临床厌氧菌鉴定新视角：MALDI-TOF Sirius与VITEK MS PRIME平台性能比较与临床应用评估

本综述系统比较了MALDI-TOF MS（基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱）两大平台——Bruker SIRIUS与bioMérieux VITEK MS PRIME在厌氧菌鉴定中的性能，证实其高准确性（属水平>97%）与临床实用性，为感染病原快速诊断及抗菌治疗策略优化提供关键技术支持。

　　

ABSTRACT

厌氧菌的属种水平快速鉴定对感染管理和抗菌治疗指导至关重要。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）已成为厌氧菌鉴定的强大工具，克服了其特殊培养要求及低生长率带来的挑战。该技术被证明可靠且高效，仅需极少量菌体生物量即可实现准确鉴定。MALDI-TOF MS在临床环境中的应用显著改善了厌氧菌鉴定，促进了恰当的治疗决策，并以较低成本改善了患者预后。本研究评估了两种MALDI-TOF质谱平台——SIRIUS（布鲁克·道尔顿）和VITEK MS PRIME（生物梅里埃）及其最新数据库的性能，使用的60株临床相关厌氧菌株均经过体外诊断（IVD）数据库验证并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。除鉴定准确性外，我们强调了快速确认厌氧菌病原体在改善临床结局中的作用。结果与现有文献（包括我们团队的性能评估）进行了比较，以凸显MALDI-TOF技术的进步。MALDI-TOF MS在鉴定厌氧菌方面表现出高准确性，属水平鉴定成功率超过97%，精密度值达100%，总体一致性为73.3%，存在一些微小差异，因此平台选择取决于各实验室的具体需求。

IMPORTANCE

快速准确鉴定厌氧菌对于指导抗菌治疗和改善患者预后至关重要，但由于该微生物的苛养特性，这仍然具有挑战性。基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱通过实现厌氧菌的高通量、成本效益高且可靠的鉴定，改变了临床微生物学。本研究使用一组临床相关厌氧菌株，对两种广泛使用的MALDI-TOF平台——布鲁克SIRIUS和VITEK MS PRIME——进行了头对头比较。通过评估其诊断准确性、重复性和数据库性能，我们的结果为实验室选择MALDI-TOF系统提供了实用见解。这些发现对改善诊断工作流程、缩短结果报告时间以及加强临床环境中的抗菌药物管理具有直接意义。此外，这项工作有助于开发国家资源和工具，以支持中低收入环境中基于MALDI-TOF的诊断。

INTRODUCTION

厌氧菌在多种微生物感染中扮演重要角色，尤其是在深部组织脓肿、菌血症和腹腔内感染中。将这些病原体快速鉴定至属种水平对于有效管理至关重要，因为厌氧菌常因生长要求苛刻以及传统鉴定方法的局限性而导致诊断延迟。基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱（MS）彻底改变了微生物诊断学，提供了高通量和精确的鉴定能力。近期对最新MALDI-TOF MS系统（如VITEK MS PRIME (VMSP) 和布鲁克Biotyper Sirius）的比较研究证明了它们在临床环境中的稳健性能，两种平台对厌氧菌和苛养菌均实现了高准确度。这些进步凸显了MALDI-TOF MS作为一线诊断工具的可靠性。

在临床环境中，MALDI-TOF MS已被用于鉴定厌氧菌血流感染，其中拟杆菌属（Bacteroides spp.）和梭菌属（Clostridium spp.）是最常分离到的微生物。该技术有助于识别院内死亡的危险因素，如年龄和实体瘤的存在。脓液抽吸物和组织样本等临床样本中厌氧菌的鉴定意义重大，常见分离株包括脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）和普雷沃菌属（Prevotella spp.），这对循证医学和抗生素治疗具有指导意义。特定病例，如厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）的鉴定，凸显了MALDI-TOF MS的精确性。该微生物以2.10的评分被鉴定，并经16S rRNA测序确认，证明了该方法在复杂病例中的可靠性。

尽管MALDI-TOF MS已被证明有效，但需注意一小部分分离株（2%）可能仍需要分子方法进行最终鉴定。这强调了在某些情况下需要辅助技术以确保全面的微生物鉴定。本研究重点比较评估两种MALDI-TOF平台——布鲁克道尔顿的SIRIUS和生物梅里埃的VITEK MS PRIME，使用一组60株厌氧菌分离株。目的是评估它们提供准确快速鉴定的能力，特别强调即时属种水平确认的临床相关性，并使用最新数据库，基于我们团队等先前的性能研究。

MATERIALS AND METHODS

Strain selection

厌氧菌物种来自我们的参考培养物收藏，包含在FDA对IVD数据库验证的K510中。来源包括深部组织活检、脓肿和无菌部位液体。所有分离株均来自单微生物培养。

共选择了60株厌氧菌，代表具有临床相关性的属和种。包括拟杆菌属（4株）、双歧杆菌属（1株）、梭菌属（9株）、芬戈尔德菌属（2株）、梭杆菌属（2株）、乳杆菌属（14株）、消化链球菌属（2株）、厌氧球菌属（1株）、卟啉单胞菌属（1株）、普雷沃菌属（3株）、丙酸杆菌属（16株）和韦荣球菌属（5株），如表1所述。

虽然乳杆菌属（Lactobacillus）物种不被认为是严格厌氧菌，但将其纳入本次性能评估是合理的，因为它们经常在厌氧培养条件下被回收，并且在涉及厌氧菌群的多微生物感染中具有临床相关性。在常规诊断工作流程中，特别是在使用富集厌氧培养基时，这些兼性厌氧或耐氧厌氧菌通常与严格厌氧菌一起生长，因此需要可靠地鉴定它们。因此，它们在测试面板中的存在反映了真实的实验室条件，并有助于更全面地评估MALDI-TOF MS平台在鉴定临床相关厌氧和微需氧细菌方面的性能。

Sample preparation

菌株按照标准方案在厌氧条件下培养：将分离株接种于5%绵羊血琼脂平板，并在37°C厌氧条件下孵育48小时。验证培养物纯度后，使用MALDI-TOF MS分析样本。根据阿根廷国家网络指南（该指南经过阿根廷参考实验室多年鉴定验证后制定），所有微生物均采用原位提取法进行鉴定，即在用商业羟基氰肉桂酸（HCCA）基质密封前加入1 μL甲酸。在两个MALDI-TOF MS仪器（SIRIUS PRIME和VITEK MS PRIME）上均进行重复（两个点）分析。由同一操作员在连续3天内进行测定，以评估结果的重复性和一致性。整个程序根据上述指南进行开发。

Instrumentation and databases

在SIRIUS设备（布鲁克·道尔顿）上，使用MBT Compass IVD v.13数据库进行鉴定。在VMSP（生物梅里埃）上，使用Knowledge Base版本3.3进行鉴定。

对于鉴定，考虑了每家制造商的建议如下：SIRIUS平台评分值≥2.00为种水平，≥1.7为属水平。评分值低于1.69视为不可靠鉴定。使用VMSP系统进行鉴定时，置信度在60.0%至99.9%之间表示可靠的种水平鉴定。低鉴别度发生在存在多于一个显著生物体/组但不超过4个时。当与超过四个生物体相似或未找到匹配时，视为无鉴定（No Identification）。

为计算总体一致性百分比，我们考虑了两个平台鉴定相同（无论是在种水平还是属水平）的分离株数量。然后，仅在某些乳杆菌物种/组中出现的不一致结果，根据CLSI标准通过16S rRNA基因测序解决。使用对应于8-27F和1492R位置的引物进行16S rRNA基因的测序和扩增。使用BigDye Terminator v.3.1循环测序试剂盒设备（应用生物系统公司）对PCR产物进行测序，并在ABI 377遗传分析仪（PE应用生物系统公司）上进行分析。将获得的序列与NCBI GenBank中存档的标准序列进行比较，使用BLAST v.2.0软件并根据CLSI标准进行解读。

Statistical comparison of species-level identification performance

为评估两种MALDI-TOF MS平台在种水平鉴定性能上观察到的差异是否具有统计学意义，对配对分类数据应用McNemar检验。基于60个测试分离株的鉴定结果构建了一个2×2列联表，比较每个平台正确进行种水平鉴定的数量。

然后，评估了性能指标，如每个平台在属和种水平的鉴定率。

RESULTS

对60株分离株进行了评估，以确定VITEK MS PRIME和SIRIUS平台的准确性、精密度和灵敏度。详细结果在补充材料中描述，性能指标总结表（包括两种评估的MALDI-TOF MS平台及其更新数据库在属和种水平上的准确性（如适用）呈现在表2中。

两个平台之间的总体一致性为73.3%（44株分离株）。具体而言，41株分离株在种水平上一致，2株在属水平上一致，1株分离株未被任一平台鉴定。这导致60例中有43例（71.7%）在属水平一致，种水平一致性为68.3%。

两个平台都表现出非常高的精密度，没有假阳性。布鲁克SIRIUS显示出稍高的准确性，在属水平上正确鉴定了一株额外的分离株，但VITEK MS PRIME提供了更多的种水平鉴定，这在特定病例中具有临床价值，例如不解糖消化链球菌（Peptoniphilus asaccharolyticus）。虽然SIRIUS系统仅将微生物鉴定到属水平（消化链球菌属 spp.），但VITEK MS PRIME系统提供了明确的种水平鉴定。这种区分至关重要，因为属内不同物种可能表现出不同的毒力和抗菌药物敏感性谱。例如，不解糖消化链球菌与多微生物感染（如骨和关节感染）有关，并且可能比以前认识的更具致病活性。此外，药敏研究表明，虽然不解糖消化链球菌通常对亚胺培南和甲硝唑等药物敏感，但在某些菌株中观察到对克林霉素和左氧氟沙星的耐药性。因此，如VITEK MS PRIME所实现的准确种水平鉴定，对于指导有效的抗菌治疗和改善患者预后至关重要。

在我们的研究中，SIRIUS系统成功地在属水平鉴定出厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius），而VITEK MS PRIME系统在任何情况下均未能鉴定出它，尽管其存在于数据库中。这种差异凸显了MALDI-TOF MS平台之间性能的可变性，特别是在厌氧菌方面。这强调了不断更新和扩展MALDI-TOF MS数据库以提高临床重要厌氧菌鉴定准确性的重要性。性能的图形表示：为补充统计分析，生成了三个图形可视化图来说明VITEK MS PRIME和SIRIUS平台之间的性能和一致性。

在评估的60株临床分离株中，两个平台在种水平正确鉴定了41株。VITEK MS PRIME单独正确鉴定了15株布鲁克SIRIUS无法鉴定的分离株，而SIRIUS鉴定了3株VITEK未能分类到种水平的分离株。只有一株分离株未被两个系统鉴定。

图1比较了每个平台进行的鉴定分布。VITEK MS PRIME在种水平鉴定了56株分离株，在属水平鉴定了2株，未能鉴定2株。相比之下，布鲁克SIRIUS在种水平鉴定了44株分离株，在属水平鉴定了15株，未能鉴定1株。

图2展示了一个总结种水平鉴定一致性的热图。最常见的结果是平台间一致，其次是仅VITEK MS PRIME正确鉴定。热图突出了性能的不对称性，这也通过McNemar检验得到证实。

这些图形总结强化了在所测试条件下VITEK MS PRIME系统卓越的种水平鉴定能力，并强调了整合视觉和统计工具进行性能评估的相关性（评分值<2.0），并且仅未能鉴定一株分离株。

最后，平台之间的总体一致性为73.3%，表明总体上具有良好的一致性，但也存在一些性能差异，如下所述。

差异主要出现在普雷沃菌属（Prevotella）内，两个平台对 Baron普雷沃菌（Prevotella baroniae）都表现优异。然而，Biotyper系统始终未能鉴定口普雷沃菌（Prevotella veroralis），评分低于1.69，视为不可靠鉴定。在韦荣球菌属（Veillonella）内，VMSP无法鉴定非典型物种，而Biotyper将分离株归类到属水平，评分值低于制造商推荐的2.0阈值。尽管如此，两个平台都正确鉴定了4株小韦荣球菌（Veillonella parvula）。

在不解糖消化链球菌（Peptoniphilus asaccharolyticus）的案例中，Biotyper系统仅达到属水平鉴定，而VMSP成功实现了种水平鉴定。所有评估的皮肤杆菌属（Cutibacterium）物种，包括痤疮皮肤杆菌（C. acnes）、贪婪皮肤杆菌（C. avidum）和南特皮肤杆菌（C. namnetense），均被两个系统以高置信度评分识别，尽管Biotyper在五例中产生的评分低于2.0。对于具核梭杆菌（Fusobacterium nucleatum）、坏死梭杆菌（Fusobacterium necrophorum）、大芬戈尔德菌（Finegoldia magna）以及大多数测试的乳杆菌物种（惰性乳杆菌 L. iners、短乳杆菌 L. brevis、唾液乳杆菌 L. salivarius、发酵乳杆菌 L. fermentum、詹氏乳杆菌 L. jensenii）也一致实现了正确的种水平鉴定。然而，虽然VMSP报告了簇，如酸乳杆菌/格氏乳杆菌（Lactobacillus acidophilus/gasseri）、 casei/副 casei/鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus casei/paracasei/rhamnosus）以及戊糖乳杆菌/植物乳杆菌/副植物乳杆菌（Lactobacillus pentosus/plantarum/paraplantarum），但Biotyper在任何情况下都未能鉴定布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），尽管进行了多次尝试。

两个数据库都无法区分粪拟杆菌（Bacteroides faecis）和多形拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）。然而，两个平台都在种水平正确鉴定了脆弱拟杆菌（B. fragilis）。在一个实例中，厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）被布鲁克Sirius系统在种水平鉴定，而VMSP库未能识别。不解糖卟啉单胞菌（Porphyromonas asaccharolytica）被生物梅里埃的IVD库以高置信度鉴定为不解糖卟啉单胞菌/uenonis（P. asaccharolytica/uenonis），而布鲁克系统仅在一次场合中产生高于2.0的评分值。

最后，梭菌/艰难梭菌属（Clostridium/Clostridioides）物种，包括产气荚膜梭菌（C. perfringens）、败毒梭菌（C. septicum）、第三梭菌（C. tertium）、落诈梭菌（C. fallax）和艰难梭菌（C. difficile），均被准确鉴定。关于未被任一系统鉴定的分离株，平均每60个测试中有6个。然而，所有分离株在重复测试后均得到正确解决。这一结果归因于我们研究中采用的重复性评估方案，其中每个分离株在连续3天内进行测试。因此，最初由于谱图质量差或置信度评分低而鉴定失败的分离株，在重新测试后成功鉴定。这种方法突出了重复分析的重要性，以克服暂时的技术限制，确保在常规临床工作流程中可靠的种水平鉴定。

为提高未来性能，必须评估和优化SIRIUS系统中的技术条件，以减少“无峰”的出现，这直接影响鉴定结果。此外，需要进一步工作来分析并微调两个平台中的置信度阈值（百分比和评分值），以提高鉴定可靠性。虽然VMSP IVD表现出更高的重复性，但在精细分类学分辨率方面可能仍会引入错误。相比之下，SIRIUS显示出对谱峰质量的更大依赖性，这虽然在某些情况下可能更准确，但当谱图质量欠佳时会影响其一致性。

Statistical comparison of species-level identification performance

在测试的分离株中，两个系统在种水平正确鉴定了41株分离株。VITEK MS PRIME正确鉴定了15株布鲁克SIRIUS未能分类到种水平的分离株，而SIRIUS成功鉴定了3株VITEK MS PRIME未能鉴定的分离株。一株分离株未被任一平台正确鉴定。由此产生的McNemar检验得出卡方值为8.0（P≈0.0047），表明性能存在统计学显著差异。这些结果支持以下结论：在本评估条件下，VITEK MS PRIME在种水平鉴定上比布鲁克SIRIUS具有更高的准确性。

DISCUSSION

本研究的结果凸显了当前MALDI-TOF平台在厌氧菌病原体鉴定方面的优势和局限性。我们的结果与近期比较VITEK MS PRIME和Biotyper Sirius的评估一致，这些评估报告了厌氧菌种水平鉴定率的类似差异，特别是对于普雷沃菌属（Prevotella）和消化链球菌属（Peptoniphilus）等属。虽然VITEK MS PRIME在重复性方面表现出色，观察到低质量谱图数量较少，减少了对重复分析的需求，但Biotyper Sirius偶尔在特定分类群上表现出更好的分类学分辨率，强调了平台特异性优化的必要性。

虽然SIRIUS和VITEK MS PRIME都能够提供属和种水平的鉴定，但它们在测试分离株中的表现存在显著差异。值得注意的是，VITEK MS PRIME在重复鉴定中表现出更高的重复性和一致性，尽管它未能鉴定某些物种，如厌氧消化链球菌（Peptostreptococcus anaerobius）。相反，SIRIUS对选定分类群显示出更好的覆盖范围，但更易受谱图质量影响，导致偶尔无法产生峰或产生低置信度匹配。两个系统都显示出中等到高水平的的一致性，但SIRIUS表现出较低的特异性，并且对技术变量（如谱图质量）更敏感。这些差异强调了优化技术方案和数据库参数的重要性，并表明在关键或模糊情况下，MALDI-TOF鉴定应辅以参考方法（例如16S rRNA测序）。最终，系统选择应基于临床背景和实验室需求，平衡通量、重复性和分类学分辨率。快速鉴定厌氧菌病原体有助于及时启动靶向抗菌治疗，降低患者发病率和医疗成本。MALDI-TOF的临床实用性通过其与分子金标准方法（如16S rRNA测序）的一致性得到进一步加强。未来的研究应探索其在直接样本工作流程中的应用，以进一步缩短诊断周转时间。

Economic impact

使用MALDI-TOF鉴定厌氧菌病原体为临床实验室提供了显著的成本节约。传统方法，如生化测试或分子方法，通常需要额外的试剂、劳动密集的程序和延长的周转时间，导致更高的运营成本。MALDI-TOF系统通过实现快速、高通量的鉴定且只需最少的消耗品需求，降低了这些费用。根据我们的经验——尽管是轶事且非来自正式的成本分析——与先前的研究一致，MALDI-TOF可以将每个样本的成本降低高达60%，并将鉴定时间比生化方法缩短24-72小时。然而，必须承认仪器所需的大量前期投资。MALDI-TOF MS系统的购置成本通常在15万至30万美元之间，具体取决于制造商、配置和服务协议。这种高昂的初始费用可能是一个限制因素，特别是对于小型实验室或中低收入国家的机构。当随时间摊销并与传统生化或分子方法相比在消耗品、劳动力和时间方面降低的成本进行权衡时，长期的经济效益仍然显著。此外，MALDI-TOF MS的可扩展性和高通量使其在处理大量微生物鉴定任务的实验室中特别具有成本效益。

与先前研究一致，实施MALDI-TOF MS快速鉴定厌氧菌与临床决策的改善相关，并且在某些背景下，与更好的患者预后相关。虽然我们的研究未直接评估临床终点，但MALDI-TOF提供及时准确的种水平鉴定的能力支持早期优化抗菌治疗和减少不必要的广谱抗生素使用，这些是影响患者护理的关键因素。通过提供准确及时的种水平鉴定，该技术允许早期优化抗菌治疗，减少经验性广谱抗生素的使用，并最大限度地降低耐药性发展的风险。

Conclusion

本研究强调了MALDI-TOF质谱在快速准确鉴定厌氧菌病原体中的重要性。SIRIUS和VITEK MS PRIME平台都是临床微生物学的宝贵工具，具有互补的优势，可增强诊断前景。这些发现与Rocca等人的先前评估一致并进行了扩展，说明了MALDI-TOF技术在临床诊断中的持续发展。本次经验的成果正在转移给阿根廷MALDI-TOF网络（RENAEM, Red Nacional de Identificación microbiológica por Espectrometría de Masas MALDI-TOF）的参与者。

这些发现也被纳入由Prieto、Rocca和Palotay开发的虚拟助手MALDI BOT中，该助手目前正在进行用户验证测试。此外，该信息有助于编写用于解释MALDI-TOF结果的开放获取指南，临床实验室可通过以下链接免费获取。这些工具旨在加强阿根廷国家MALDI-TOF诊断网络内的解释、决策和协作知识共享。

ACKNOWLEDGMENTS

我们感谢布鲁克·道尔顿和生物梅里埃的技术团队对他们的支持和提供MALDI-TOF平台。