基于原位拉曼光谱的深海微生物硫代谢动态相对定量分析揭示光调控新机制

本研究开发了一种基于共聚焦拉曼光谱（confocal Raman spectroscopy）的创新方法，利用氮气（N2）作为内标，首次实现了深海黄杆菌（Erythrobacter flavus）21-3在固体培养基中硫酸盐（SO42?）的原位定量和零价硫（S8）的动态可视化监测。研究发现自然光照通过促进硫酸盐生成和表层S8积累（与类胡萝卜素共富集）驱动光依赖的硫代谢转化，而黑暗条件下S8主要储存在亚表层。该非侵入性技术为微生物介导的元素循环研究提供了全新分析框架。

　　

INTRODUCTION

硫是深海生态系统中生物地球化学循环的核心元素。在缺氧沉积物中，硫酸盐作为关键的微生物电子受体，其在海水中浓度可达28 mM。硫酸盐还原产生中间价态硫物种，包括零价硫，这些物种驱动着相互关联的元素循环。作为零价硫的重要形式，环八硫（S₈）既可作为微生物的能量储存载体，也是活性硫氧化的生物标志物。近期在中国南海冷泉群落中通过拉曼光谱检测到S₈，并证实了微生物在硫化物转化中的作用。因此，对硫酸盐、S₈及相关硫物种的定量研究对于解析深海环境中微生物驱动的硫循环至关重要。

传统研究多采用色谱或化学计量学方法在液体培养基中测量代谢物动力学，但这些方法存在显著局限性：无法获得长期原位数据、操作复杂、易受采样环境干扰，且因采样异质性和污染而影响准确性。固体培养基通过直接可视化菌落形态和硫物种空间分布，为研究微生物过程提供了独特优势。然而，该方法对培养基中预先存在的分子（特别是硫酸盐这种海水普遍成分）的绝对定量存在根本挑战，因为其定量方法依赖于存在-缺失标准而非浓度梯度。

近年来，拉曼光谱因其无需样品预处理的原位分子表征能力、快速采集时间以及多组分同时分析能力，已成为生物检测的革命性分析平台。该技术通过实现复杂基质中的长期原位无损定量和定性分析，克服了传统方法的固有局限性。共聚焦拉曼显微镜通过卓越的空间分辨率和检测灵敏度，进一步提升了这些能力，允许在完整固体培养基内可视化微生物定植动态和代谢物分布模式。

本研究前期从深海冷泉沉积物中分离出黄杆菌（Erythrobacter flavus）21-3，并表征了其独特的硫代硫酸盐向硫酸盐和S₈的转化途径。为研究该菌株内含硫组分的动态变化，采用共聚焦拉曼光谱对其生长和硫转化进行了长期、近实时监测，包括S₈产量的量化。关键的是，虽然S₈（代谢产物）可直接定量，但硫酸盐的定量需要创新的标准化方法，因为其在固体培养基中持续存在。鉴于硫酸盐是影响微生物代谢的关键溶解性海洋成分，本研究引入氮气作为内标，以实现其在固相系统中的定量。

RESULTS AND DISCUSSION

Modeling of Raman quantitative analysis

虽然拉曼信号强度与被测物质浓度正相关，但其强度也受激发光强度、被测物质拉曼散射截面和设备参数的影响。根据拉曼光谱强度归一化理论，同一被测溶液中物质“a”和“b”的拉曼特征峰面积比与其对应浓度正相关。计算采用公式：A_a/A_b = (C_a/C_b) × (σ_a/σ_b) × (η_a/η_b) = (C_a/C_b) × (F_a/F_b)，其中A代表被测物拉曼特征峰面积，C代表浓度，σ代表拉曼散射截面，η代表与测量设备参数相关的系数值，F代表量化因子。

此计算方法已广泛用于液体或气体的定量分析。对于液体混合物，水是常用的内标峰，但在本研究的固体培养基系统中，水参与微生物代谢，其峰在后期不稳定。研究偶然发现可在培养基表面测量到氮气的稳定拉曼峰，因此尝试引入不参与反应且稳定存在的氮气作为内标。使用氮气去除拉曼腔室内所有空气，并将气压维持在0.3 MPa，以确保氮气浓度稳定并消除压力变化对检测结果的潜在影响。

为证明方法的可行性，以海水中含量丰富且在微生物介导的硫循环中起重要作用的硫酸盐为模型。由于先前研究发现微生物生长和代谢过程主要发生在培养基表面，本定量方法仅针对表面，忽略培养基内可能的浓度变化。将等体积无菌培养基注入培养容器，并保持严格水平对齐以确保冷却后凝固界面水平，通过同时最大化明场图像清晰度以及氮气和目标分析物的特征拉曼峰强度来确定最佳焦点位置。

为确定硫酸盐含量，分别收集浓度为25 mmol/L至75 mmol/L的硫酸钠溶液在气固界面的光谱，并获得校准曲线。然后确定硫酸盐分子与氮气分子的峰面积比与硫酸盐分子浓度的关系。每个样品在气固界面的至少三个不同位置收集光谱以最小化实验误差。

通过高斯拟合，分别确定了硫酸盐（约980 cm^?1，S-O伸缩振动）和氮气（2,332 cm^?1，N≡N伸缩带）的拉曼峰面积。定量模型方程为：A_SO?2?/A_N? = 0.01802 × C_SO?2? ? 0.04239 (R2 = 0.99938)。该模型主要适用于氮气压力0.3 MPa下固体培养基中约25–75 mmol/L的硫酸盐范围。

Quantitative Raman analysis of sulfur cycling processes mediated by E. flavus 21-3 under natural light conditions

为验证固体培养基中硫酸盐的实时监测能力，本研究系统表征了E. flavus 21-3介导的硫循环过程中的动态组成变化。该菌株独特的将硫代硫酸盐歧化为硫酸盐和S₈的代谢能力，结合类胡萝卜素在增强嗜极适应性中的关键作用（维持膜完整性、减轻环境压力如高静水压和低温、并在无光深海条件下提供抗氧化保护）。因此，除了追踪硫酸盐特异性拉曼特征外，还在后期监测阶段检测到了S₈和类胡萝卜素的特征峰。

由于类胡萝卜素的拉曼峰与硫酸盐混合，在分析前应用高斯拟合方法使用构建的定量模型进行处理。对于仅在后期产生的代谢物S₈和类胡萝卜素，基于其相应的振动模式进行单变量拉曼成像，以显示其含量和分布的变化。使用470 cm^?1处的S-S振动峰重建S₈，使用1,523 cm^?1处多烯链的C=C键代表培养基中的类胡萝卜素。

在初始孵育期（0–32 h），微生物生长伴随着S₈和类胡萝卜素的持续积累，而硫酸盐产量适度增加。在中期孵育期（32–48 h），S₈和类胡萝卜素继续积累，硫酸盐产量显著加速，表明生物量的增加促进了硫代硫酸盐产生S₈和硫酸盐。48小时后，硫酸盐产量逐渐下降，并伴随着S₈的消耗，而类胡萝卜素的积累持续放缓。关键的是，157小时后，类胡萝卜素在S₈沉积区域内聚集并以接近恒定的速率继续积累；然而，S₈的消耗显著减少。这种时空分布的变化意味着底物的再利用，S₈可能在能量限制条件下作为后期代谢维持的底物。

值得注意的是，硫酸盐动力学与液体培养趋势一致，S₈的再分布模式与先前的硫形态研究相匹配。这些一致性验证了原位固相定量方法的可靠性。总体而言，这种空间分布和含量的变化表明菌株E. flavus 21-3的生长与硫循环过程内在相关。

Raman quantitative analysis of E. flavus 21-3 sulfur metabolic processes under dark conditions

在先前的研究中，意外发现光调节E. flavus 21-3的生长及其硫代谢途径。研究数据的初步分析表明，光照条件下S₈的合成增强，这促使我们研究这种光响应背后的机制。为了进一步量化光对E. flavus 21-3介导的硫循环的调节作用，并评估常规实验室环境光是否掩盖了这种深海微生物的内在代谢过程，建立了黑暗条件下的平行培养系统。这种比较方法使我们能够进一步了解光调节对菌株21-3硫代谢过程的影响。

在黑暗条件下，虽然硫酸盐浓度变化曲线的趋势与自然光照条件下相似，呈持续上升趋势，但与自然光照下培养的菌落相比，生产速率显著减慢，暗示光在加速代谢过程中的关键作用。此外，S₈和类胡萝卜素的合成周期延长，需要更多时间才能达到可检测浓度。由于光照减少直接抑制了类胡萝卜素的生产速率，在黑暗条件下仅在54小时检测到类胡萝卜素的生产。后期未检测到类胡萝卜素可能归因于生活在黑暗和光照下细菌的不同生活方式。

值得注意的是，虽然在培养基表面未检测到S₈生产，但在180小时时在亚表层观察到了它的形成。这种空间特异性分布表明了动态代谢适应。与此一致的是，早期的三维成像数据揭示，菌落产生的S₈不会持续沉积在表面，而是在延长培养过程中表现出纵向迁移。在低氧条件下，菌落将硫封装在内部。这些模式表明，光与氧气浓度一样，是控制硫空间分布的关键环境因素。

在本研究中，光照条件下，类胡萝卜素和S₈在表面的共富集可能依赖于光驱动的硫代谢。相反，缺乏光能输入时，丰富的内部有机碳源环境有利于S₈作为能量储备的产生。这种光-硫代谢模型揭示了深海微生物通过整合光感通路来优化硫资源利用的独特适应机制，为理解黑暗生态系统中微生物的能量储存策略提供了新视角。

Conclusion

通过建立结合时空可视化的原位定量 assay，本研究阐明了不同光 regime 下微生物的生长动态和代谢适应，为实时追踪固体介质中的生物地球化学过程提供了一个新颖的分析框架。未来实施集成的三维拉曼扫描与深度依赖信号校正将显著增强时空物质分布分析和定量通量分析的准确性。结合表面增强拉曼散射（SERS）用于低浓度代谢物检测，这个多模态平台将成为跨尺度生物学研究的多功能工具，推进微生物生态系统功能在硫循环中的量化，同时实现基质中硫封存机制的研究。

MATERIALS AND METHODS

Cultivation of E. flavus 21-3

E. flavus 21-3在26°C的2216E培养基中培养。培养基包括1 g酵母提取物、5 g色氨酸和15 g琼脂，溶于1 L人工海水。人工海水包含24.5 g NaCl、3.9 g Na₂SO₄、0.7 g KCl、0.02 g SrCl、5.0 g MgCl·6H₂O、1.1 g CaCl₂、0.2 g NaHCO₃、0.03 g H₃BO₄和0.004 g NaF/L每1 L Milli-Q水，pH用1 M NaOH调节至7.2–7.5范围。40 mM硫代硫酸钠经0.22 μm滤膜灭菌后加入高压灭菌的培养基中。为确保实验可重复性，所有试验均严格保持标准化的初始条件。培养基制备后，将无菌琼脂转移至连接氮气瓶的拉曼反应室。E. flavus 21-3的培养物接种在琼脂培养基表面的中心。连续氮气吹扫主动置换大气气体，同时将顶空压力精确控制在0.3 MPa。在光照实验中，细菌在实验室中始终暴露于自然光。在黑暗培养实验中，除拉曼测定外，透光窗口始终用黑布覆盖。

Raman spectra acquisition

本研究使用配备532 nm激发激光器的共聚焦拉曼显微光谱仪（alpha 300R, WITec, Ulm, Germany），并选择OLYMPUS SLMPlan N 20×/0.25物镜（Olympus Corporation, Tokyo, Japan）进行拉曼光谱采集。该设备采用背照式电荷耦合器件（CCD）相机与UHTS 300光谱仪联用。使用的光栅是600 groove/mm光栅，可实现3 cm^?1的光谱分辨率。通过测量标准单晶硅片在520 cm^?1的特征拉曼峰进行波长校准。

对于固体培养基中的硫酸盐定量建模，在0.3 MPa氮气气氛下的温压控制拉曼室中分析具有浓度梯度的样品。激光聚焦在气固界面，从不同位置的三到五个重复点收集光谱以最小化误差。激光功率设置为30 mW，以确保足够的信号强度同时防止样品光毒性。采用3秒积分时间和60次累积，以获得具有适当信噪比的光谱。

接种菌落培养后，为确保数据可比性，基于菌落中心进行光谱采集。在相对于中心的相同空间范围内进行扫描。步长通常设置在20至30 μm之间，与菌落直径成比例，以全面捕捉菌落组分的空间分布。同时，激光功率降低至20 mW，每光谱积分时间缩短至1–1.5秒，以减轻对微生物群落的潜在光毒性。后续处理方案包括对多个空间光谱进行平均，以补偿区域扫描中每个点因较短积分时间和较低功率而可能导致的信噪比下降，从而为后续分析提供高质量、可比的数据。

Processing of Raman spectral data

监测菌落时获取的数据首先使用软件WITec Project plus（Control Five 5.2, WITec Company, Ulm, Germany）进行分析。所有拉曼数据集都经过相同的预处理，包括宇宙射线去除和基线校正。细节在He等人的研究中进行了 meticulous 描述。使用WITec Project plus软件对类胡萝卜素富集区（1,523 cm^?1）和环八硫S₈富集区（470 cm^?1）的振动模式进行单变量成像。处理后的数据集中的所有光谱然后被求和平均，以产生代表整体情况的拉曼平均光谱。所有光谱最终使用GRAMS/AI 9.3（Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA）光谱数据处理软件进行处理。基线校正后，使用高斯函数进行峰拟合，以确定谱带位置、宽度、高度和面积，用于定量分析。

ACKNOWLEDGMENTS

本研究得到以下基金资助：国家自然科学基金（42327805, 42221005），中国科学院海洋研究中心重点项目（COMS2020J03），中国博士后科学基金（2024M751269），以及山东省自然科学基金（ZR2024QD074）。

X.Z., C.S., 和 W.H. 构思并设计了研究。W.H. 完成了大部分实验。C.S. 和 R.C. 制备了样品。W.H., R.C., X.G., J.Z., C.S., 和 X.Z. 分析了数据。Y.Z., S.X., L.L., 和 Z.D. 提供了实验室管理和技术支持。W.H. 和 R.C. 撰写了手稿。C.S. 和 X.Z. 修改了手稿。X.Z., C.S., 和 Z.L. 参与了资金获取、项目管理和监督。所有作者阅读并批准了最终手稿。