新型隐球菌临床株的全球蛋白质组学分析揭示潜伏性与致死性感染的显著差异 中文标题

本研究通过先进的质谱蛋白质组学技术，结合体内感染模型和患者来源临床菌株，系统揭示了隐球菌感染中宿主-病原体互作的蛋白动态。研究发现潜伏性感染与致死性感染（包括典型和高毒力株）的宿主肺部蛋白质组响应存在根本差异：潜伏感染特征为细胞外基质（ECM）重组和细胞粘附通路富集，而死性感染则主导宿主防御（如Arg1、Epx、Mmp12）、翻译及代谢过程。病原体层面，潜伏株UgCl223体内高表达核小体组蛋白（H2A、H3、H4）和钙调蛋白（calmodulin），而死性株上调热休克蛋白（Hsp90）和延伸因子（EF-1α、EF-2）。该研究为感染结局预测提供了关键蛋白靶点（如Hsp90疫苗潜力），并深化了对真菌 virulence 机制的理解。

　　

摘要

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是艾滋病患者中致死率最高的真菌病原体之一，其感染始于肺部，免疫控制失效会导致中枢神经系统播散性疾病和死亡。本研究利用基于质谱的蛋白质组学技术、体内感染模型及患者来源临床菌株，探究了与菌株毒力差异相关的隐球菌感染蛋白质组谱。研究结果显示，非致死性潜伏感染产生的蛋白质组响应与致死性感染存在显著差异，且尽管死亡时间不同，典型和高毒力感染的蛋白质组谱却惊人相似。总体而言，小鼠肺部蛋白质组响应在潜伏感染中表现为细胞外基质组织、细胞粘附和结构变化相关蛋白及通路的富集，而死性感染则以宿主防御、翻译和代谢过程为主。这些结果提供了关于不同隐球菌菌株如何导致显著不同感染结局的临床相关信息，并鉴定出在潜伏和致死性隐球菌感染中高丰度的真菌蛋白，这些蛋白可能成为未来的药物靶点。

引言

播散性真菌病的结果往往是宿主防御和病原体攻击共同作用的结果。随着蛋白质组学技术的进步，我们能够更好地研究这些复杂的相互作用，以确定宿主-病原体战争的进行方式并更好地预测疾病结局。新型隐球菌是一种机会性真菌病原体，占全球HIV相关死亡率的20%。暴露于隐球菌是通过吸入环境中的孢子发生的，免疫抑制和未能将感染控制在肺部会导致播散性疾病（隐球菌病）。虽然早期积极的临床感染治疗和潜在人类免疫缺陷的管理对提高生存率至关重要，但研究表明，毒力因子的病原体特异性差异可能进一步影响疾病结局。事实上，用患者来源的隐球菌临床菌株感染免疫 competent A/J小鼠可重现原始人类宿主的疾病结局，隐球菌小鼠模型为了解病原体毒力决定因素和宿主防御策略提供了见解。因此，更好地了解感染菌株的差异如何影响疾病结局具有巨大的临床意义。为此，我们之前进行了一项全基因组关联研究，以确定导致人类疾病的单核苷酸多态性以及隐球菌临床菌株中菌株特异性毒力差异。为了了解隐球菌临床菌株之间的蛋白质差异如何影响菌株毒力和疾病结局，我们分析了不同毒力临床菌株的蛋白质组谱。

基于质谱的患者来源病原体蛋白质组谱分析先前已成功鉴定出差异富集的蛋白质和毒力因子。此外，受感染宿主组织的蛋白质组谱分析可以揭示微生物防御过程中涉及的蛋白质和通路，为了解疾病反应过程中哪些环节正确或错误提供了见解。研究感染蛋白质组的一种有效方法是一起处理来自感染组织的宿主和病原体细胞，然后在分析过程中通过生物信息学方法分离生物体的蛋白质组。这种双视角方法可用于探测宿主-病原体相互作用的整个蛋白质景观，并在同一实验中鉴定出临床干预或诊断识别的相关蛋白质。在这里，我们使用全局蛋白质组谱分析研究了小鼠肺部和高毒力隐球菌临床菌株的蛋白质组变化。我们显示，潜伏感染诱导的宿主免疫反应与典型或高毒力菌株的死性感染显著不同。我们的研究结果揭示了非致死性潜伏感染如何诱导与死性感染引起的反应显著不同的蛋白质组响应，以及尽管死亡时间存在差异，典型和高毒力感染的蛋白质组谱却出乎意料地相似。这些结果提供了关于不同隐球菌菌株如何导致显著不同感染结局的临床相关信息。我们还鉴定出了在潜伏和致死性隐球菌感染中丰度较高的候选靶标真菌蛋白。

材料与方法

隐球菌培养生长条件

新型隐球菌血清型A临床分离株UgCI223（潜伏性）和UgCI422（高毒力），以及典型的实验室参考菌株KN99α，从30%甘油储备液中划线接种到含有酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）和氯霉素琼脂的平板上，在30°C下培养48小时。然后将少量培养物转移到2 mL YPD肉汤中，在30°C和225 RPM的摇速下培养18小时。培养样品（每个菌株n = 4）用PBS洗涤并重悬于1 mL PBS中，然后在液氮中速冻并储存于-80°C。

小鼠感染

A/J小鼠（品系#000646，Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）经鼻内感染5 × 10⁴个UgCI223细胞以产生潜伏感染，或感染KN99α或UgCl422以产生典型致死性或高毒力致死性感染（n = 35；五只未感染，每次感染10只）。感染后14天（DPI），用CO₂处死小鼠，取出其肺部并收集到10 mL管中。组织样品然后在液氮中速冻并储存于-80°C。

样品制备

肺部和培养样品按照先前描述的方法进行处理。简而言之，样品在含有蛋白酶抑制剂混合物（Roche，Basel，Switzerland）的100 mM Tris (pH 8.4)缓冲液中通过珠磨均质至少5分钟。加入20%的十二烷基硫酸钠（SDS）至终浓度为10%（体积/体积），样品通过探头超声（30%振幅，30秒开，30秒关）进行五个循环的物理裂解。样品用1%（体积/体积）的1 M二硫苏糖醇还原，并在95°C和800 RPM的摇床加热块上孵育10分钟。然后样品用10%（体积/体积）的0.55 M碘乙酰胺烷基化，在室温下避光孵育20分钟，离心去除碎片，用80%（体积/体积）的冰冷丙酮稀释，并在-20°C下孵育过夜。蛋白质沉淀通过在10,000 × g和4°C下离心收集，用80%冰冷丙酮洗涤，并风干。蛋白质沉淀重悬于200 μL的8 M尿素、40 mM HEPES缓冲液中，并在4°C水浴中超声处理。通过牛血清白蛋白（BSA）测定法量化蛋白质浓度。蛋白质样品在600 μL的50 mM碳酸氢铵中稀释至2 M尿素。将25 μg蛋白质转移到新的LoBind管（Eppendorf，Hamburg，Germany）中，用Pierce胰蛋白酶/Lys-C蛋白酶混合物（蛋白质:酶比例为25:1，Thermo Scientific，Waltham，MA）消化，并在室温下孵育过夜。通过加入10%（体积/体积）的终止溶液（20%乙腈和6%三氟乙酸）停止消化。使用C18三层树脂Stop And Go Extraction (STAGE) tips分离肽段，使用速度真空在45°C下干燥45分钟，并储存于4°C。

液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)

LC-MS/MS按照先前描述的方法进行。简而言之，消化的肽样品重悬于0.1%甲酸中，并注入到Orbitrap Exploris 240混合四极杆-Orbitrap质谱仪中，该仪器与Vanquish Neo超高效液相色谱系统（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）耦合。使用内联75 mm × 50 cm PepMap RSLC EASY-Spray柱（填充有2 mm C18反相硅胶珠，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）分离肽段。肽段通过线性梯度为4%至45%的流动相B（含有80%乙腈和0.1%甲酸；流动相A为0.1%甲酸水溶液）在300 nL/min的流速下经过3小时的梯度洗脱，然后在100%流动相B下洗涤15分钟，电喷雾电离进入质谱仪。MS数据通过数据非依赖采集（DIA）在Orbitrap质量分析器中获取，MS1在400–900 m/z范围内，分辨率为60,000，MS2扫描在400至900 m/z范围内，间隔为10 m/z，分辨率为15,000。

数据处理

使用MaxQuant软件（Ver. 2.6.4.0，Max Planck Institute of Biochemistry，Planegg，Germany）进行原始数据处理和小鼠蛋白质的肽库搜索。启用MaxDIA，并针对Mus musculusUniProt蛋白质组参考库（Taxon ID 10090，87492个条目，下载于2025年3月4日）进行搜索。消化参数设置为trypsin/P，启用无标记定量，最小比率计数设置为1。鉴定蛋白质的最小肽段数设置为2。启用运行间匹配。

对于新型隐球菌蛋白质的鉴定，使用DIA-NN软件（Ver. 1.9.2，Ralser Group，University of Cambridge，Cambridge，England）和新型隐球菌血清型A H99 UniProt参考蛋白质组（Taxon ID 235443，7439个条目，下载于2024年9月8日）进行数据处理和非库搜索。

原始LC-MS/MS及相关文件已提交至ProteomeXchange Consortium，通过PRIDE合作伙伴存储库，数据集标识符为PXD063417（项目登录号：PXD063417，令牌：9DZ3u5h8R6g7）。

统计分析

使用Perseus软件（Ver. 2.1.3.0，Max Planck Institute of Biochemistry，Planegg，Germany）进行统计分析。样品按感染条件进行注释。然后，LFQ强度进行log₂转换，并过滤在一个条件下≥60%样品中检测到的有效值。缺失值（NA）通过奇异值分解（SVD）或最大似然估计（MLE）进行插补，强度通过中位数减法进行归一化。使用Student’s t检验和Benjamini-Hochberg多重假设校正（FDR为0.05）确定统计显著性（P值 < 0.05）。每次比较的fudge factor (s0)使用siggenes R包（fudge2()）进行调整。使用自定义Python K-means聚类脚本（K = 3）生成主成分分析（PCA）聚类。K聚类数量使用肘部法确定。使用heatmapper.ca（Wishart Research Group，University of Alberta，Edmonton，Canada）制作蛋白质丰度的热图和层次树状图。维恩图改编自DeepVenn（Hulsen Group，Philips，Eindhoven，Netherlands）。

结果

潜伏性隐球菌感染诱导与致死性感染显著不同的宿主肺部蛋白质组响应

我们先前表明，肺隐球菌感染的组织学和免疫学特征因感染分离株而异。为了确定菌株特异性毒力差异如何影响宿主肺部蛋白质组响应，我们用潜伏性疾病临床分离株UgCl223、典型性疾病参考分离株KN99α或高毒力性疾病临床分离株UgCl422感染小鼠，并在感染后14天（DPI）与未感染小鼠相比，表征了全局宿主肺部蛋白质组的变化。

首先，我们进行了感染与未感染小鼠蛋白质组的比较，以鉴定显著改变的蛋白质丰度。然后我们生成了一个主成分分析（PCA）图，观察到潜伏感染小鼠与典型感染、高毒力感染和未感染小鼠分开。我们应用了K-means聚类算法，发现聚类三包含了所有潜伏感染蛋白质组。聚类成员资格的卡方分析显示样品分布是非随机的（P值 < 0.001）。所有显著蛋白质的欧几里得聚类热图显示，典型和高毒力感染小鼠聚集在一起，而潜伏感染小鼠单独聚集。有趣的是，未感染小鼠蛋白质组比潜伏感染小鼠更接近典型和高毒力感染小鼠。我们比较了感染与未感染小鼠的蛋白质命中，鉴定出781个显著改变的蛋白质。典型感染与未感染相比，显示出207个显著不同的蛋白质丰度：74个丰度较低，133个丰度较高。潜伏感染显示出600个显著不同的蛋白质丰度：443个丰度较低，157个丰度较高。高毒力感染显示出89个显著不同的蛋白质丰度：17个丰度较低，72个丰度较高。我们观察到典型和高毒力感染之间有更多的重叠（58个富集蛋白质），而潜伏感染与典型和高毒力比较的宿主蛋白质重叠较少（分别为19和11个富集蛋白质）。有趣的是，我们只观察到耗竭的潜伏和富集的高毒力条件之间有一个蛋白质重叠：非典型促炎性谷胱甘肽S-转移酶蛋白Gsto1。

然后将显著富集和耗竭的蛋白质输入STRING数据库，以根据其生物过程基因本体（GO）术语确定富集通路。与未感染小鼠相比，感染典型分离株的小鼠显示出涉及防御和免疫反应以及氨基聚糖分解代谢过程的通路富集，并表现出脂蛋白颗粒组装和组织、磷脂外流和CoA转移酶调节的耗竭。感染高毒力感染的小鼠也具有涉及防御和免疫反应的通路富集，以及粒细胞和中性粒细胞迁移和吞噬作用，同时同样表现出脂蛋白颗粒组织的耗竭。潜伏感染小鼠具有涉及蛋白质定位到CENP-A-containing染色质和负调控细胞群体增殖的通路富集，以及NAD、NADH、小分子代谢、解毒和内肽酶调节的耗竭。

感染也相互比较以鉴定疾病表现特异性差异。与典型和高毒力感染相比，潜伏感染富集了细胞外基质组织、细胞-底物粘附、循环系统过程和对生长因子β的细胞反应，而典型和高毒力感染均富集了小分子代谢、生物合成过程和翻译通路。典型和高毒力感染没有显著不同的通路富集，但在一个蛋白质上确实存在显著差异：前2型精氨酸酶蛋白Arg1。

我们对已鉴定GO术语通路中的蛋白质丰度进行了直接分析。我们分析了来自防御反应通路的12种蛋白质：Arg1、Cd68、Epx、Ifgr1、Mmp12、Mpo、Muc5b、Ear10、Gtso1、B4galt1、Irgm2和Prtn3；三种氨基聚糖分解代谢蛋白质：Chil1/Chia1、Chil3和Chil4；以及八种细胞外基质蛋白质：Col1a1、Col1a2、Col3a1、Col4a4、Col5a2、Fga、Fgg和Fgb。致死性典型和高毒力感染具有显著更高的防御反应蛋白丰度，除了干扰素γ受体蛋白Ifngr1，其在潜伏感染中显著增加。此外，Gsto1在潜伏感染中显著耗竭。典型感染产生显著更高的Arg1丰度、前2型嗜酸性粒细胞衍生蛋白Epx、免疫调节金属蛋白酶Mmp12和凋亡负调控因子B4galt1，而高毒力感染增加了Irgm2和Prtn3的水平。所有隐球菌感染均诱导氨基聚糖分解代谢蛋白的显著增加，但在致死性感染中更高。典型感染甚至产生更显著升高的Chil1/Chia1和Chil3。潜伏感染表现出胶原蛋白（Col 1a1、Col1a2、Col3a1、Col4a4和Col5a2）和纤维蛋白原（Fga、Fgg和Fgb）的显著增加。有趣的是，典型感染导致Col1a1和Fgb的显著耗竭。

我们先前表明潜伏性隐球菌感染产生肺部肉芽肿。因此，我们还检查了另外五种与肉芽肿形成相关的宿主蛋白质：活性氧（ROS）生成蛋白CYBB和Ncf1、免疫细胞警报素蛋白S100a9、细胞外基质成分Vtn和肺部保护性载脂蛋白ApoE。肉芽肿形成与ROS生成缺陷、细胞外基质组织增加以及促进中性粒细胞和单核细胞迁移有关。潜伏感染产生的CYBB和Ncf1显著低于典型和高毒力感染，并且S100a9也显著低于致死性感染和未感染。此外，Vtn丰度在高毒力感染中显著较低，而ApoE丰度在潜伏感染中较低。

临床菌株在体外彼此之间比与参考菌株更相似

为了确定临床分离株的蛋白质组是否存在可能有助于其观察到的疾病表现差异的内在差异，我们对在丰富培养基YPD中体外生长的隐球菌培养物进行了全局蛋白质组分析和比较。

我们进行了PCA分析，发现成分一代表了两个潜伏培养样品与其余培养物之间的差异（24.3%），成分二将临床分离株（潜伏和高毒力）与典型KN99α培养物分开（20.1%）。应用K-means聚类显示，聚类1包含所有四个高毒力培养样品和两个潜伏培养样品；聚类2包含所有四个典型培养样品；聚类3包含两个潜伏培养样品。随机分布的卡方分析表明存在显著的非随机聚类（P值 < 0.01）。我们可视化了培养物和显著蛋白质丰度之间的关系，观察到潜伏和高毒力培养物（共享相同的进化枝）比典型培养物（孤立的进化枝）更接近地聚类。我们注意到潜伏和高毒力培养物之间有25个重叠蛋白质，而典型和高毒力培养物之间有8个重叠蛋白质，典型和潜伏培养物之间有8个重叠蛋白质。然后我们试图使用马尔可夫聚类算法（MCL）聚类来确定富集的蛋白质功能注释，以鉴定富集的术语。总的来说，典型培养物富集了与氧化能量衍生、糖代谢、DNA复制、胆碱代谢、线粒体膜间隙和胞质大核糖体亚基相关的术语；潜伏培养物富集了DNA损伤反应和修复、半乳糖和多糖代谢、DNA代谢和混合生物合成过程；高毒力培养物富集了未表征的内质网蛋白质和混合硫载体和L-苯丙氨酸分解代谢。潜伏和高毒力培养物差异不够显著，无法产生MCL聚类。

潜伏性新型隐球菌菌株产生与致死性疾病引起菌株不同的独特蛋白质组

虽然我们的发现表明我们的潜伏和高毒力临床菌株体外培养蛋白质组彼此之间比我们的典型参考菌株更相似，但我们试图确定体内蛋白质组差异是否可能有助于疾病表现特异性发病机制。因此，我们对从感染后14天的小鼠肺部分离的隐球菌蛋白质进行了全局蛋白质组分析，比较了体内蛋白质组，并鉴定了显著改变的蛋白质。

从我们的PCA图分析中，我们观察到沿着成分1（23.6%）的致死性和潜伏性菌株之间的变异性，以及沿着成分2（18.0%）的潜伏性菌株与致死性菌株的分离。应用我们的K-means聚类后，聚类1包含八个潜伏和一个典型蛋白质组。聚类2包含五个典型和六个高毒力蛋白质组，聚类3包含三个典型、四个高毒力和两个潜伏蛋白质组。卡方分析显示聚类成员资格对于非随机分布是显著的（P值 < 0.001）。我们发现潜伏性隐球菌菌株基于显著改变的蛋白质命中丰度与典型和高毒力菌株分开分组。我们对菌株之间的比较显示，我们的典型菌株与我们的高毒力菌株共享所有七个富集蛋白质，而高毒力菌株展示了一个独特蛋白质：DNA复制许可因子Mcm3 (CNAG_00099)。我们还表明，虽然六个富集的潜伏蛋白质在比较之间共享，但分别有五个和八个蛋白质是潜伏菌株与典型和高毒力菌株比较所特有的。为了增加我们蛋白质通路富集分析的统计效力，我们将所有显著的潜伏蛋白质归类为“潜伏”类别，并将典型和高毒力蛋白质归类为“致死”类别。对富集GO术语的STRING数据库搜索显示，致死性菌株显著富集了翻译、RNA结合、GTP结合以及核苷三磷酸和核糖核苷酸活性分子功能通路，而潜伏菌株则富集了染色质结构、蛋白质异源二聚化、GTP酶活性和结合通路。

我们进一步将我们的显著蛋白质鉴定分为两组：核小体核心相关蛋白质，包括组蛋白H2A、组蛋白H3、组蛋白H4、前mRNA剪接因子Rse1、H/ACA核糖核蛋白复合物亚基Cbf5、液泡蛋白质分选相关蛋白4、Rab家族蛋白和GTP结合蛋白RYH1；以及翻译相关蛋白质，包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶、延伸因子1-α、延伸因子2、延伸因子Tu、钙调蛋白、Hsp90样蛋白、小单体GTP酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶、线粒体乌头酸水合酶、肽链释放因子1、ATP合酶亚基α和ATP合酶亚基β。对于核小体核心蛋白，致死性菌株产生更多的液泡蛋白质分选相关蛋白4。潜伏菌株产生显著更高水平的DNA复制许可因子H/ACA核糖核蛋白复合物亚基Cbf5、组蛋白H2A、前mRNA剪接因子Rse1、组蛋白H3、组蛋白H4、GTP结合蛋白RYH1和Rab家族蛋白。对于翻译相关蛋白，致死性菌株表现出显著更高的S-腺苷甲硫氨酸合成酶、延伸因子1-α、延伸因子2、肽链释放因子1和应激反应Hsp90样蛋白的丰度。潜伏菌株表现出增加的延伸因子Tu、线粒体乌头酸水合酶、ATP合酶亚基β、ATP合酶亚基α、小单体GTP酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶和钙调蛋白。

讨论

我们试图了解隐球菌肺部感染的蛋白质组景观，并确定有助于宿主防御反应和真菌毒力表型的蛋白质和通路差异。我们发现，从宿主-病原体动态的宿主和病原体角度来看，潜伏性隐球菌感染与致死性感染显著不同。我们鉴定了几种与观察到的疾病表现差异相关的蛋白质和通路。我们报告：（1）宿主对潜伏感染的反应涉及细胞外基质组织通路和干扰素γ（IFNγ）受体蛋白Ifngr1的富集；（2）宿主对典型和高毒力感染的反应富集了防御反应、生物合成和翻译过程；（3）潜伏菌株UgCl223的体内隐球菌蛋白质组与典型KN99α和高毒力UgCl422致死性菌株显著不同，致死性菌株的蛋白质组彼此之间没有显著差异。此外，我们观察到隐球菌临床菌株在体外彼此之间比实验室生成的参考菌株KN99α更相似。最终，我们的结果表明，存在几个关键的、临床相关的疾病表现特异性蛋白质和通路存在差异，并提供了对隐球菌疾病结局潜在机制的见解。

我们对隐球菌感染的全局宿主蛋白质组分析表明，潜伏性、典型性和高毒力感染产生了独特的蛋白质特征，显著地将潜伏反应与致死反应分开。虽然隐球菌感染可预测地升高了几种防御反应蛋白，但感染之间宿主蛋白质丰度的差异表明整体宿主反应存在巨大分歧。先前的研究确定，隐球菌KN99α通常产生非保护性的2型主导免疫反应，其特征是嗜酸性粒细胞增多、IL-4和IL-13产生以及2型辅助T细胞。一致地，我们在此显示，KN99α典型感染产生了2型相关蛋白（如Arg1、Epx和Ear10）的最大升高，而潜伏感染产生的最少。

我们还鉴定出氨基聚糖分解代谢通路，包含几丁质酶样蛋白（CLPs）Chil1/Chia1、Chil3和Chil4，在潜伏和致死感染中富集。Chil1/Chia1在致死感染中丰度最高。当暴露于几丁质（隐球菌细胞壁的主要成分）时，CLPs诱导促炎性2型免疫反应和组织重塑。先前的研究表明，宿主CLPs有助于KN99α典型致死感染期间的2型主导免疫反应。事实上，我们这里的发现表明，我们的2型主导致死感染产生了更高的CLPs丰度，这支持了CLPs在可能有助于无效2型真菌反应的宿主防御反应中发挥作用。

我们还观察到细胞外基质蛋白的变化。典型感染中Mmp12和B4galt1增加，它们分别参与细胞外基质的降解和免疫细胞浸润。高毒力感染表现出更高的Prtn3，它降解细胞外基质以促进中性粒细胞迁移。致死感染期间参与细胞外基质降解的蛋白质丰度较高与肺结构完整性的丧失和免疫细胞的流入一致。相反，潜伏感染中胶原蛋白和纤维蛋白原的丰度增加，这些蛋白参与肺实质的结构完整性，并且重要的是，参与肺肉芽肿的形成。

此外，我们对与肉芽肿形成相关的免疫蛋白分析显示，参与NADH氧化酶介导的活性氧（ROS）生成的CYBB和Ncf1，以及中性粒细胞和单核细胞警报素S100a9，在潜伏感染中显著低于致死感染。先前的研究表明，CYBB和Ncf1的缺陷以及S100a9的增加促进肉芽肿形成。因此，潜伏感染中的肉芽肿形成，至少在早期阶段，可能归因于ROS真菌杀灭能力的缺陷。肉芽肿形成免疫蛋白的这些差异进一步支撑了潜伏和致死感染之间肉芽肿形成能力的显著偏差以及导致死亡率的肺组织破坏差异。

通过分析隐球菌体外培养的全局蛋白质组，我们的目标是鉴定关键毒力因子中可能使菌株倾向于特定疾病表现的疾病表现特异性差异。我们在此报告，在测试的菌株中，先前建立的毒力因子（如几丁质脱乙酰酶、甘露蛋白、脲酶、磷脂酶或黑色素）没有差异。相反，我们发现我们的临床来源菌株彼此之间比实验室生成的KN99α参考菌株更相似。这并不奇怪，因为UgCl223和UgCl422都是从感染HIV的乌干达患者中分离出来的，并且在进化上更相似，而KN99α是一种实验室生成的菌株，源自1978年从一名患有霍奇金淋巴瘤的美国患者收集的临床分离株H99，并且在进化上与乌干达分离株不同。相反，我们注意到菌株之间在糖代谢、DNA代谢和生物合成注释方面存在差异。因此，我们的解释是，这些菌株之间的疾病表现特异性差异源于不同的应激反应通路，而不是毒力因子的内在差异。

我们对感染后隐球菌蛋白质组的分析揭示了体内差异，进一步突出了潜伏性和致死性疾病之间的对比。首先，我们发现潜伏菌株产生更高的组蛋白丰度是令人惊讶的。虽然染色质重塑和组蛋白乙酰化先前已被证明对隐球菌在宿主感染期间的生存很重要，但我们的发现表明，组蛋白积累的增加，无论是由于降解通路缺陷还是产生增加，可能有助于这种潜伏菌株的生存能力。事实上，Feser等人的一项研究表明，增加酵母中组蛋白的积累可以延长寿命和生存能力。组蛋白去乙酰化酶1（HDAC1）的表达显著影响隐球菌的生存和毒力因子产生。此外，H3的差异甲基化可能具有生物学相关性，因为我们的潜伏菌株缺乏S-腺苷甲硫氨酸合成酶，该酶合成通用甲基供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）。

有趣的是，我们发现潜伏和致死隐球菌菌株在两种关键应激反应蛋白的丰度上存在差异，分别是钙调蛋白和Hsp90样蛋白。钙调蛋白与钙（Ca²⁺）和钙调神经磷酸酶（一种丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，在我们的潜伏菌株中也升高）相互作用，以促进耐热机制和体内生存。相反，我们的典型和高毒力致死菌