TMEM147作为肺腺癌免疫抑制预后生物标志物的多组学整合分析揭示其促癌机制与治疗潜力

本研究针对肺腺癌(LUAD)预后差、治疗靶点稀缺的临床难题，通过多组学整合分析首次揭示内质网膜蛋白TMEM147在LUAD中的致癌作用。研究发现TMEM147通过调控核糖体生物合成与氧化磷酸化(OXPHOS)通路促进肿瘤进展，并诱导免疫抑制微环境，其高表达与患者不良预后显著相关（AUC=0.831）。该研究为LUAD提供了新的预后标志物和潜在治疗靶点，对改善免疫治疗效果具有重要意义。

　　

在全球癌症负担中，肺癌始终占据着令人瞩目的位置，每年新发案例占所有癌症的11.4%，而相关死亡病例更是接近癌症总死亡数的20%，成为威胁人类健康最严重的恶性肿瘤之一。根据组织学特征，肺癌主要分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)，其中NSCLC约占85%，而肺腺癌(LUAD)又是NSCLC中最常见的亚型。尽管近年来放疗、系统治疗、分子靶向及免疫治疗取得了显著进展，晚期NSCLC患者的临床结局仍不理想，五年生存率持续处于较低水平，这凸显了探索新的预后生物标志物和治疗靶点的迫切性。

TMEM147是一个新近发现的25 kDa内质网(ER)膜蛋白和核膜蛋白，具有七个完整的跨膜结构域。内质网膜是细胞执行关键功能的重要场所，特别是脂质生物合成。越来越多的证据表明，TMEM147具有广泛的组织分布，暗示其可能参与多种生理过程。先前的研究发现该蛋白在结直肠癌组织中显著上调，表明其可能的诊断价值。此外，来自同一基因组位点的反义长链非编码RNA TMEM147-AS1在前列腺癌中调节肿瘤细胞生长和转移中起关键作用。然而，TMEM147在LUAD中的功能角色仍属未知。

为解决这一问题，研究人员开展了一项整合生物信息学分析与实验验证的研究。该研究首次证实TMEM147在LUAD组织中显著上调，并通过刺激细胞增殖、迁移和侵袭促进癌症进展，相关成果发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》。研究通过生物信息学分析确定了调控TMEM147表达的潜在转录因子，揭示了TMEM147表达模式与LUAD患者临床结局的显著相关性，并通过功能富集分析和蛋白互作网络构建阐明了分子机制，同时考察了TMEM147与肿瘤免疫微环境特征的关系。

研究采用的主要技术方法包括：从TCGA和GEO数据库获取LUAD转录组和临床数据；使用DESeq2进行差异表达基因分析；通过GO/KEGG和ssGSEA进行功能富集分析；利用STRING数据库构建蛋白互作网络；应用ESTIMATE算法和CIBERSORTx分析免疫细胞浸润；通过Western blotting、Transwell实验、伤口愈合实验和克隆形成实验进行体外功能验证；整合六大数据平台预测转录调控因子。

3.1. TMEM147在肺腺癌中高表达且与不良预后相关

研究分析TCGA数据集发现TMEM147在33种癌症类型中显著上调，尤其在LUAD中。匹配肿瘤和癌旁组织分析证实其在肿瘤中显著上调。TCGA LUAD队列分析显示TMEM147在肿瘤组织中表达显著高于配对正常对照，这一发现在两个独立的GEO数据集(GSE102287和GSE118370)中得到验证。生存分析表明高TMEM147表达与较差的总生存期(OS)、疾病特异性生存期(DSS)和无进展间隔期(PFI)显著相关。受试者工作特征(ROC)曲线显示TMEM147的曲线下面积(AUC)值为0.831，表明其对LUAD检测具有强大的预后价值。

3.2. TMEM147表达水平与临床特征的相关性

研究提取TCGA数据库中LUAD病例的临床记录，发现TMEM147表达与多种临床病理参数存在显著相关性：人口学因素(年龄、性别、种族)、疾病特征(TNM分期、组织学分级、肿瘤位置)、进展标志物(病理分期、肿瘤状态)、治疗结果(残留肿瘤)和行为因素(吸烟史)。TMEM147表达与OS和DSS显示特别强的关联，但与PFI无显著关系。

3.3. FLI1是LUAD中TMEM147的潜在调控因子

为阐明控制TMEM147过表达的转录调控网络，研究采用生物信息学方法预测潜在的上游调控因子。整合六个预测数据库确定FLI1为候选转录因子。后续差异表达分析显示FLI1在TCGA队列和GSE102287数据集的LUAD样本中显著降低。值得注意的是，TMEM147与FLI1表达呈显著负相关，暗示潜在的调控关系。Motif图展示了转录因子结合序列，由JASPAR数据库预测，选择得分大于10的序列进行绘图，预测的结合位点序列的相对位置在图中显示。

3.4. TMEM147在LUAD中的功能分析

研究人员将病例基于TMEM147转录量化分为高表达和低表达亚组，使用DESeq2进行基因表达谱分析，应用严格标准(调整后p值<0.05和绝对log2倍数变化>1)鉴定统计学显著的差异表达基因。该方法鉴定出1272个显著失调基因，包括646个上调和626个下调转录本。后续HTSeq-Counts评估显示10个最显著改变的基因。差异基因的GO富集分析显示共表达基因主要参与核糖体蛋白生物合成、线粒体基因表达和氧化磷酸化(BP：生物过程)；线粒体内膜、核糖体(CC：细胞成分)；核糖体结构组成、氧化还原活性(MF：分子功能)等相关功能。KEGG通路分析也发现TMEM147富集于与核糖体和氧化磷酸化相关的几个信号通路。

3.5. TMEM147表达与免疫细胞浸润的关系

使用单样本基因集富集分析(ssGSEA)，研究系统评估并测量了TMEM147表达模式与肿瘤微环境中免疫细胞浸润的关联。研究进一步证实TMEM147表达与效应记忆T细胞(Tem)、中央记忆T细胞(Tcm)、嗜酸性粒细胞和辅助T细胞呈负相关，与γδ T细胞(Tgd细胞)和Th2细胞呈正相关。通过TIMER数据库分析体细胞拷贝数改变(SCNA)模块发现TMEM147拷贝数变异(缺失或扩增)与LUAD中免疫细胞浸润水平显著相关。为进一步研究TMEM147的免疫调节作用，研究人员根据TMEM147转录水平将LUAD患者分为高表达和低表达组，能够对亚组间的肿瘤免疫微环境特征进行比较评估。发现Tgd和Th2细胞增加(P<0.05)，Tem、Tcm、嗜酸性粒细胞和辅助T细胞减少(P<0.05)。这些结果证实LUAD中TMEM147高表达与免疫细胞抑制密切相关。随后，研究使用CIBERSORTx对TME进行更详细的解卷积，能够阐明TMEM147的表达与特定免疫亚型相关。例如，它与CD8⁺T细胞和Treg细胞呈负相关。研究还使用GEPIA网站分析LUAD数据集中TEME147与免疫检查点PD-L1和CTLA4的相关性，它们的表达呈负相关。

3.6. 鉴定与TMEM147共表达的10个枢纽基因

通过STRING分析，研究检测到10个与TMEM147相互作用的共调控基因，包括CCDC47、NCLN、NOMO2、RPL22、RPL32、RPL38、RPL8、SEC61A1、SEC61B和TMCO1。随后在LUAD标本中量化这10个候选基因，显示所有已鉴定的互作因子表达一致上调。为表征LUAD中涉及TMEM147的分子网络，研究分析了该基因与十个功能相关靶点的共表达模式。结果显示TMEM147转录水平与七个核糖体/分泌通路基因存在显著正相关(p<0.05)，包括NCLN、多个RPL家族成员(RPL22、RPL38、RPL8)、SEC61亚基(SEC61A1、SEC61B)和TMCO1。为阐明TMEM147相关基因在LUAD中的生物学作用，研究进行了GO和KEGG通路分析。

3.7. TMEM147促进肺腺癌的增殖、迁移和侵袭

为研究TMEM147在肺腺癌中的功能，研究验证了TMEM147在肺上皮细胞和肺腺癌细胞系中的表达。随后使用siRNA在NCI-H1299和A549细胞中敲低TMEM147表达，Western blot分析证实了TMEM147敲低效率。克隆形成实验证明TMEM147沉默显著降低了NCI-H1299和A549细胞系的增殖能力。Transwell实验显示TMEM147敲低显著降低了NCI-H1299和A549细胞的迁移和侵袭能力。伤口愈合实验进一步证实TMEM147抑制抑制了NCI-H1299和A549细胞的迁移。

研究结论表明，TMEM147在LUAD中上调，与不良预后(AUC=0.831)和晚期临床病理学相关。FLI1反向调控TMEM147，与核糖体生物合成和OXPHOS相关。TMEM147通过Th2/Tgd细胞浸润和Tem减少促进免疫抑制。沉默TMEM147抑制LUAD增殖、迁移和侵袭。这些发现突出了TMEM147作为预后生物标志物和治疗靶点的重要性，值得探索FLI1介导的调控和免疫治疗协同作用。

讨论部分深入阐述了研究的多个维度意义。数据集分析显示TMEM147在肺腺癌组织中相比正常对照显著增加，其高表达与TNM分期、病理分级和较差患者生存密切相关。ROC曲线分析显示TMEM147具有高诊断效率(AUC=0.831)，表明其作为独立预后指标的潜在效用。这一发现与先前在结直肠癌中的研究一致，但本研究首次验证了其在LUAD中的临床价值。值得注意的是，TMEM147表达与吸烟史和肿瘤残留状态等临床参数显著相关，暗示其可能参与由环境致癌物(如烟草暴露)驱动的恶性转化过程。

FLI1通过六个数据库的联合分析被预测并验证为TMEM147的关键转录调控因子。作为ETS家族成员，FLI1在多种癌症中具有促进或抑制癌症的双重作用。有趣的是，FLI1表达在LUAD中下调，并与TMEM147呈显著负相关，表明它可能通过抑制TMEM147转录而发挥肿瘤抑制因子作用。这一发现拓宽了我们对LUAD表观遗传调控网络的理解。

功能富集分析显示TMEM147相关差异基因显著富集于核糖体生物合成和氧化磷酸化通路。结合PPI网络分析，TMEM147与多个核糖体蛋白(如RPL22、RPL8)和内质网转运蛋白(如SEC61A1)共表达。这表明它可能通过内质网-核糖体耦合发挥作用：TMEM147定位于内质网膜，可能通过SEC61A1(内质网转运通道蛋白)介导新生肽链的共翻译和转运，确保核糖体和内质网的动态耦合。核糖体质量控制：RPL22等核糖体蛋白参与核糖体组装和rRNA修饰，TMEM147可能通过调节其稳定性影响核糖体成熟。KEGG还显示TMEM147相关基因富集于OXPHOS通路，机制可能涉及调节线粒体-内质网接触(MERCs)。TMEM147定位于内质网膜，可能通过MERCs调节Ca²⁺信号(影响线粒体ATP合成)或脂质转运(如心磷脂合成)。核糖体-OXPHOS协同：核糖体生物合成需要大量ATP(由OXPHOS提供)，TMEM147可能通过增强核糖体活性间接促进OXPHOS需求。电子传递链(ETC)组分调节：SEC61A1参与线粒体膜蛋白(如复合物IV亚基)的共翻译插入，TMEM147可能通过调节转运效率影响ETC功能。

此外，本研究揭示了TMEM147表达与肿瘤免疫浸润模式的关联。TMEM147高表达组中Th2细胞和Tgd细胞浸润增加，而效应记忆T细胞(Tem)和辅助T细胞减少。Th2极化通常通过分泌IL-4/IL-13促进M2型巨噬细胞分化，而Tgd细胞在多种癌症中具有免疫抑制特性，两者共同构成促肿瘤免疫微环境。同时，TMEM147的体细胞拷贝数改变(SCNA)与免疫细胞浸润水平显著相关，表明它可能通过基因组不稳定性间接调节TME。研究发现TMEM147表达与关键免疫检查点分子PD-L1(CD274)和CTLA-4呈显著负相关，表明TMEM147高表达可能伴随免疫检查点分子下调，从而影响免疫治疗反应。这一发现与最近关于肿瘤微环境中代谢重编程和免疫检查点表达调节的研究相呼应。

除了观察到的相关性，研究提出了关于TMEM147在促进免疫抑制性TME中机制作用的有趣假设。首先，鉴于其已确定的内质网定位以及与核糖体生物合成和OXPHOS的关联，推测TMEM147可能通过代谢重编程协调免疫逃逸。增强的OXPHOS(通常与TMEM147活性相关)可能导致TME中营养耗竭(如葡萄糖、谷氨酰胺)和活性氧(ROS)或乳酸产生增加。这种代谢恶劣的生态位已知会损害效应T细胞(如发现的减少的Tem和辅助T细胞)的功能和增殖，同时促进调节性免疫亚群的扩增和抑制活性。其次，TMEM147在核糖体生物合成和蛋白质合成中的潜在作用暗示了另一种机制：它可能对免疫抑制性细胞因子或趋化因子的高效生产和分泌至关重要。例如，肿瘤经常分泌IL-10、TGF-β或VEGF等因子来抑制抗肿瘤免疫。与TMEM147共表达的SEC61A1(内质网转运通道的关键组分)对此类可溶性因子的分泌至关重要。假设TMEM147通过稳定SEC61A1或增强内质网转运通道效率，促进特定细胞因子组的分泌，招募如Tgd和Th2细胞等促肿瘤免疫细胞，同时排斥细胞毒性淋巴细胞。

值得注意的是，NSCLC的代谢异质性已显示显著影响治疗反应。研究表明肿瘤内不同细胞亚群通过差异利用营养底物(如葡萄糖、谷氨酰胺)或激活替代代谢通路(如氧化磷酸化、脂肪酸氧化)驱动治疗抵抗。本研究发现TMEM147通过调节核糖体生物合成和氧化磷酸化(OXPHOS)促进LUAD进展，表明它可能是代谢异质性的关键调节因子。特别令人感兴趣的是，TMEM147介导的OXPHOS激活可能增强癌症细胞在靶向治疗或化疗下的生存——与最近发现的代谢适应性抵抗机制高度一致。

TMEM147在免疫抑制和代谢重编程中的已识别作用与目前处于临床评估中的几种新兴治疗策略相一致。值得注意的是，针对TMEM147相关通路的干预可能克服现有治疗的抵抗。在OXPHOS抑制剂中，IACS-010759(NCT03291938)在依赖线粒体代谢的晚期实体瘤(包括NSCLC)中显示潜力，特别是对于TMEM147驱动的OXPHOS亚型。鉴于研究发现TMEM147上调OXPHOS，将OXPHOS抑制剂与TMEM147靶向治疗结合可能协同抑制LUAD中的代谢适应。针对逆转TMEM147介导的免疫抑制的免疫调节策略。抗IL-4/IL-13抗体Dupilumab联合PD-1抑制剂(NCT05069935)拮抗Th2极化。核糖体生物合成抑制剂CX-5461(NCT02719977)是首个针对晚期实体瘤中核糖体合成通路的RNA聚合酶I抑制剂，其对Myc驱动肿瘤的早期疗效表明可能适用于TMEM147过表达的LUAD。这些进展为基于TMEM147分子分型的精准治疗提供了临床转化框架。

除了其在免疫调节和核糖体功能中的作用，新兴证据表明失调的Hippo-YAP/TEAD信号是肺癌治疗抵抗的关键介质。转录共激活因子YAP在Hippo通路失活后，与TEAD复合驱动促生存和促增殖基因，赋予NSCLC对靶向治疗和常规治疗的抵抗。值得注意的是，几种YAP/TEAD抑制剂正处于临床研究中以克服这种抵抗。虽然研究未直接探索TMEM147与Hippo信号的相互作用，但观察到的TMEM147驱动的核糖体生物合成和OXPHOS通路富集可能间接维持YAP/TEAD活性。核糖体过度激活和线粒体能量学已知支持如YAP等致癌转录因子。未来研究应检验TMEM147是否通过增强YAP/TEAD轴促进治疗抵抗，可能将TMEM147定位为与新型YAP/TEAD抑制剂的共同靶点。

综上所述，本研究通过多组学整合分析和实验验证，首次系统揭示了TMEM147在肺腺癌中的致癌作用及其对免疫抑制性肿瘤微环境的调节机制，为LUAD的诊断和治疗提供了新的生物标志物和潜在靶点，具有重要的临床转化价值。