MAPK信号级联通过翻译后调控介导生物胁迫相关的尼古丁生物合成

本研究揭示了烟草中一个由NtMEKK1b-NtMPKK2a-NtMPK4组成的MAPK信号级联模块，该模块通过翻译后修饰机制正向调控茉莉酸(JA)和病原体激发子(如flg22)诱导的尼古丁生物合成。研究人员通过酵母双杂交、荧光互补成像(LCI)和Phos-tag磷酸化分析等技术证实了激酶间的相互作用与磷酸化关系，并利用RNAi沉默和条件性过表达实验证明该级联通过增强NtERF221转录因子的反式激活活性来上调PMT等关键基因表达。该发现不仅深化了对植物特殊代谢产物翻译后调控机制的理解，还为开发低尼古丁烟草品种提供了新的分子靶点。

　　

在植物与环境的复杂互动中，烟草作为一种重要的经济作物，其产生的尼古丁不仅是导致吸烟成瘾的关键物质，更是植物抵御昆虫和微生物侵袭的重要防御化合物。尽管科学家们已经揭示了茉莉酸(JA)信号通路及多个转录因子如ERF189、ERF199和ERF221在尼古丁生物合成中的核心调控作用，但大多数研究聚焦于转录水平调控。然而，实际生产中，通过沉默这些转录因子或关键酶基因来降低尼古丁含量的尝试往往效果有限，且常伴随严重的生长缺陷，这暗示着可能存在更为精细的翻译后调控机制尚未被发掘。

以往研究表明，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路在植物应对生物和非生物胁迫中扮演关键角色，但其在次级代谢产物合成中的具体功能仍知之甚少。特别值得注意的是，此前研究发现MAPK抑制剂PD98059能抑制JA诱导的ERF221对PMT和QPT启动子的反式激活作用，暗示MAPK信号可能参与尼古丁合成的调控，但具体的信号通路组件及其功能机制仍是一片空白。

为了填补这一领域的关键知识缺口，美国肯塔基大学的研究团队在《The Crop Journal》上发表了最新研究成果，系统解析了一个全新的MAPK信号级联模块在烟草尼古丁生物合成中的翻译后调控机制。

研究团队主要运用了分子互作验证技术（酵母双杂交Y2H和荧光互补成像LCI）、磷酸化检测技术（Phos-tag凝胶电泳）、功能获得与缺失实验（RNA干扰沉默和地塞米松DEX诱导的过表达）以及生理生化分析（实时定量PCR和气相色谱-火焰离子化检测GC-FID）等多种方法。实验材料包括烟草品种‘Samsun NN’的毛状根和稳定转基因植株，以及本氏烟叶片瞬时表达系统。

3.1. NtMAPKKs的全基因组鉴定

通过系统进化分析，研究团队从烟草基因组中鉴定出10个NtMAPKK基因，其中NtMPKK2a和NtMPKK2a与拟南芥AtMPKK2亲缘关系最近，被选为后续研究对象。

3.2. NtMPKK2a与尼古丁途径基因共表达且受JA诱导

转录组分析显示，NtMPKK2a在根中高表达，且与尼古丁合成关键基因共表达。JA处理0.5小时后其表达迅速上调，而NtMPKK2b的表达则下降，表明两者虽序列高度相似但功能可能分化。

3.3. NtMPKK2a与NtMPK4互作并磷酸化后者

酵母双杂交和LCI实验证实NtMPKK2a与NtMPK4存在物理相互作用。通过Phos-tag实验进一步证明，组成型活化的NtMPKK2a^DD能在植物体内磷酸化NtMPK4。

3.4. 敲低NtMPKK2s抑制烟草毛状根中尼古丁生物合成

RNAi沉默NtMPKK2s后，尼古丁途径基因（如NtPMT、NtQPT、NtBBL和NtMATE1）的表达显著下降，尼古丁含量减少20-30%。

3.5. NtMPKK2a过表达诱导尼古丁生物合成

DEX诱导的NtMPKK2a过表达毛状根中，尼古丁途径基因表达上调，尼古丁含量显著增加。

3.6. NtMPKK2s增强NtERF221对NtPMT启动子的反式激活活性

在本氏烟叶片中，共表达NtMPKK2a和NtERF221可协同激活NtPMT启动子活性，表明NtMPKK2a可能通过磷酸化内源MAPK增强转录因子活性。

3.7. NtMEKK1s的全基因组鉴定与序列比对

系统进化分析鉴定出3个NtMEKK1候选基因，其中NtMEKK1b与拟南芥AtMEKK1亲缘关系最近。

3.8. NtMEKK1b与NtMPKK2a互作

酵母双杂交显示只有NtMEKK1b与NtMPKK2a特异性互作。AlphaFold结构预测提示两者之间存在灵活的瞬态互作界面。

3.9. RNAi沉默NtMEKK1b降低转基因烟草植株中尼古丁积累

稳定转基因烟草中沉默NtMEKK1b导致尼古丁途径基因表达急剧下降，尼古丁含量显著降低。

3.10. 过表达NtMEKK1b诱导烟草毛状根中尼古丁生物合成

DEX诱导的NtMEKK1b过表达显著上调尼古丁途径基因表达并增加尼古丁含量。

3.11. NtMEKK1b增强NtERF221对NtPMT启动子的反式激活活性

瞬时表达实验证明NtMEKK1b能显著增强NtERF221介导的NtPMT启动子激活。

3.12. JA和flg22处理诱导NtMEKK1b磷酸化

Phos-tag分析发现NtMEKK1b在本氏烟叶片中存在自磷酸化，JA和flg22处理可进一步增强其磷酸化水平。

研究最终揭示了一个完整的MAPK信号级联模块NtMEKK1b-NtMPKK2a-NtMPK4，该模块通过翻译后磷酸化机制将外部生物胁迫信号（如JA和flg22）转化为细胞内信号，通过增强NtERF221等转录因子的活性和尼古丁生物合成基因的表达，正调控尼古丁的合成积累。

这一发现的重要意义在于：首先，它首次在烟草中鉴定了一个完整的MAPK级联通路专门调控特殊代谢产物合成，深化了对植物信号转导与代谢调控网络的理解；其次，研究揭示了翻译后修饰在植物特殊代谢中的关键作用，为解决通过转录调控难以完全抑制尼古丁合成的难题提供了新思路；最后，该发现的信号通路组件为开发低尼古丁烟草品种提供了新的分子育种靶标，具有重要的农业应用价值。此外，该级联信号模块能够整合多种环境信号的特点，也为研究植物如何平衡生长防御和代谢投入提供了新的视角。