小麦miR9668负调控TaRPM1-1A增强耐盐性的分子机制解析

本研究针对土壤盐渍化严重制约小麦生产的重大问题，聚焦于小麦miRNA调控耐盐性的分子机制。研究人员通过分子生物学和遗传学方法，发现tae-miR9668通过直接切割TaRPM1-1A mRNA负调控其表达，而TaRPM1-1A过表达显著增强小麦耐盐性，其与TaSnRK1.3-D的互作进一步揭示了盐胁迫响应通路。该研究为小麦耐盐育种提供了重要的基因资源和理论依据。

　　

土壤盐渍化已成为制约全球农业生产的最主要非生物胁迫因素之一，严重影响作物生长发育的各个阶段。据统计，全球有超过9亿公顷的土地受到盐渍化影响，其中灌溉农业用地占相当大比例。随着气候变化和人类活动加剧，土壤盐渍化问题日益严重，对作物生产构成重大障碍，特别是对于世界第二大谷物作物——小麦而言。中国作为全球最大的小麦生产国，由于缺乏耐盐小麦品种，盐渍化导致小麦产量和品质受到严重限制。因此，深入解析小麦耐盐性的分子机制，挖掘耐盐基因并用于分子育种，成为保障粮食安全和促进农业可持续发展的重要策略。

以往研究表明，NBS-LRR蛋白在植物抗病性中发挥关键作用，这类蛋白包含N端核苷酸结合位点(NBS)和C端富亮氨酸重复序列(LRR)结构域。除生物胁迫外，NBS-LRR基因也参与植物对非生物胁迫的适应过程。其中，RPM1作为拟南芥中首个被鉴定的CC-NBS-LRR蛋白，能够特异性识别病原菌效应子激活免疫反应。有趣的是，转基因水稻过表达AtRPM1表现出增强的干旱/盐耐受性，暗示这类基因在非生物胁迫中可能扮演重要角色。然而，小麦中TaRPM1同源基因是否参与盐胁迫响应尚未见报道。

另一方面，微小RNA(miRNA)作为真核生物中长度21-24核苷酸的非编码单链小RNA，通过与其靶基因的互补配对调控转录丰度，从而影响植物生长、发育、病原响应和非生物胁迫反应。近年来，随着染色质免疫沉淀和高通量测序技术的发展，大量盐胁迫响应miRNA被鉴定出来，但仅有少数被证实具有耐盐功能。例如，过表达MIR394a/b的拟南芥及其靶基因LCR的功能缺失突变体对盐胁迫高度敏感，而过表达LCR则增强耐盐性；水稻中miR396b-GRF6模块通过调控干重和产量显著增强耐盐性。

先前转录组测序发现，耐盐小麦品种青麦6号(QM6)在盐胁迫下tae-miR9668显著下调，而其预测靶基因TaRPM1-1A(TraesCS1A03G0058100)可能是该miRNA的关键作用靶点。然而，这两个基因如何参与小麦耐盐性调控尚不清楚。为此，研究人员在《The Crop Journal》上发表了题为"tae-miR9668 negatively regulates TaRPM1-1A to enhance salt tolerance in wheat"的研究论文，系统解析了tae-miR9668-TaRPM1-1A模块在小麦耐盐性中的调控机制。

本研究主要采用以下关键技术方法：采用农杆菌介导的遗传转化方法获得tae-miR9668和TaRPM1-1A过表达转基因小麦株系；通过GUS瞬时表达、双荧光素酶报告基因检测(Dual-luc)和RLM-5' RACE实验验证miRNA与靶基因的调控关系；利用酵母双杂交(Y2H)筛选和双分子荧光互补(BIFC)技术鉴定蛋白互作关系；采用体外pull-down和磷酸化实验验证蛋白互作及 kinase活性；通过酵母耐盐实验评估TaSnRK1.3-D的耐盐功能。所有实验均以耐盐小麦品种青麦6号(QM6)为材料进行基因克隆，以栽培品种Fielder为背景获得转基因株系。

3.1. 从QM6中克隆tae-miR9668和TaRPM1-1A

研究人员首先从耐盐小麦品种QM6中克隆了tae-pre-miR9668和TaRPM1-1A基因序列。测序显示tae-pre-miR9668长139 bp，具有稳定的茎环结构；TaRPM1-1A编码序列长2754 bp，编码918个氨基酸的蛋白，预测分子量为103.54 kDa，等电点为6.52。功能结构域预测显示该蛋白包含CC结构域(氨基酸20-108)、NB-ARC结构域(氨基酸182-424)和7个LRR结构域(氨基酸570-699)，属于典型的CC-NB-LRR基因。亚细胞定位表明TaRPM1-1A主要定位于细胞核和细胞质中。

3.2. 过表达TaRPM1-1A增强小麦耐盐性

表达分析发现，盐胁迫下TaRPM1-1A在地上部表达下调，而在根中诱导表达，且随着胁迫时间延长，根中表达保持较高水平。为研究TaRPM1-1A的耐盐功能，研究人员获得了TaRPM1-1A过表达株系。在300 mmol L^-1 NaCl处理下，野生型小麦对盐胁迫敏感，叶片明显萎蔫，而过表达植株保持直立，株高、鲜重、干重显著高于野生型，相对电导率较低。生理指标检测显示，盐胁迫下过表达株系的POD、SOD、CAT和APX活性显著提高，MDA、H₂O₂和O₂^-水平显著降低，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量显著增加。DAB染色进一步证实过表达株系H₂O₂积累减少。RT-qPCR分析发现脯氨酸生物合成基因P5CS和蔗糖生物合成基因6-SFT显著诱导表达，表明TaRPM1-1A过表达通过促进抗氧化活性、减少氧化损伤和改善渗透调节来增强小麦耐盐性。

3.3. 过表达tae-miR9668降低小麦耐盐性

表达分析显示盐胁迫下tae-miR9668在地上部和根中均下调，且下调程度随胁迫时间延长而增加。tae-miR9668过表达株系在盐胁迫下表现出对盐胁迫的高度敏感性，叶片明显萎蔫，株高、鲜重、干重显著低于野生型，相对电导率较高。生理指标显示盐胁迫下过表达株系的抗氧化酶活性显著降低，氧化损伤指标显著升高，渗透调节物质含量显著降低，表明tae-miR9668过表达通过抑制抗氧化能力、增强氧化损伤和破坏渗透平衡来削弱耐盐性。

3.4. TaRPM1-1A受tae-miR9668负调控

表达分析发现tae-miR9668过表达株系中TaRPM1-1A表达显著降低，且随着tae-pre-miR9668表达水平升高，TaRPM1-1A表达相应降低。GUS瞬时表达实验显示，共注射tae-pre-miR9668-GUS和TaRPM1-1A-GUS的叶片GUS染色显著减弱。双荧光素酶报告实验进一步证实tae-miR9668抑制TaRPM1-1A表达。RLM-5' RACE实验鉴定出tae-miR9668在TaRPM1-1A转录本第939和940碱基对之间的切割位点，过表达株系切割频率达90.5%，而野生型仅为25.0%，表明TaRPM1-1A受tae-miR9668负调控且切割效率与tae-miR9668丰度正相关。

3.5. TaSnRK1.3-D是TaRPM1-1A的互作蛋白

通过酵母双杂交筛选，研究人员发现一个编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的基因(TraesCS4D03G0483600)与TaRPM1-1A存在相互作用。该基因编码序列长1530 bp，编码510个氨基酸的蛋白，包含STKc-AMPK-alpha结构域，属于蔗糖非发酵-1相关蛋白激酶1(SnRK1)家族，被命名为TaSnRK1.3-D。三维互作模型预测显示两个蛋白形成10个氢键和3个盐桥。酵母双杂交点对点 assay和双分子荧光互补实验均证实TaRPM1-1A与TaSnRK1.3-D存在互作。体外pull-down实验进一步验证了两个蛋白的直接物理互作。体外磷酸化实验证实TaSnRK1.3-D对TaRPM1-1A具有激酶活性。

3.6. TaSnRK1.3-D正向调控耐盐性

表达分析发现盐胁迫下TaSnRK1.3-D在地上部和根中均上调表达，与其互作伙伴TaRPM1-1A的表达模式相似。亚细胞定位显示TaSnRK1.3-D主要定位于细胞核和细胞质中，与TaRPM1-1A的定位模式一致。酵母耐盐实验表明，在含NaCl的SG-Ura平板上，表达TaSnRK1.3-D的酵母比对照生长显著更好，且在1.5 mol L^-1 NaCl时只有表达TaSnRK1.3-D的酵母能够生长，证实TaSnRK1.3-D具有耐盐功能。

研究表明，tae-miR9668-TaRPM1-1A模块在小麦盐胁迫响应中扮演关键角色。盐胁迫下tae-miR9668表达下调，解除其对靶基因TaRPM1-1A的抑制，使TaRPM1-1A表达上调，进而通过增强抗氧化酶活性、减少活性氧积累、促进渗透调节物质合成等途径提高耐盐性。研究人员还发现TaRPM1-1A与TaSnRK1.3-D蛋白互作，且TaSnRK1.3-D本身具有耐盐功能，可能通过磷酸化修饰激活TaRPM1-1A介导的耐盐通路。

该研究首次揭示了小麦中tae-miR9668-TaRPM1-1A模块在盐胁迫响应中的调控机制，发现了TaSnRK1.3-D这一新的互作蛋白，完善了小麦耐盐分子调控网络。研究结果不仅为理解小麦耐盐机制提供了重要理论依据，而且为分子育种改良小麦耐盐性提供了有价值的基因资源（tae-miR9668、TaRPM1-1A和TaSnRK1.3-D）。通过调控这一模块，有望培育出耐盐性强的小麦新品种，对于应对土壤盐渍化问题、保障粮食安全具有重要意义。