纳米纤维素诱导肺部炎症与免疫应答的机制研究：基于体内外模型的毒理学评价

本研究针对纳米纤维素(NC)吸入暴露的潜在健康风险，通过大鼠气管内滴注和肺泡巨噬细胞模型，系统评估了不同类型NC（CNF1、CNF2、CNC1）的肺毒性及免疫效应。研究发现NC的生物学效应受纤维形态、表面特性和沉积行为显著调控，虽然其毒性低于多壁碳纳米管(MWCNT)，但仍需建立材料特异性的毒性评估框架。该研究为NC的安全应用提供了重要毒理学依据。

　　

随着纳米纤维素（Nanocellulose, NC）在工业、生物医学和消费品领域的广泛应用，其包含的可吸入组分（＜10μm）引发的潜在呼吸暴露风险日益受到关注。尽管应用范围不断扩大，但关于NC诱导的肺部及全身免疫效应的数据仍然有限。特别是纤维素纳米纤丝（Cellulose Nanofibrils, CNFs）和纤维素纳米晶体（Cellulose Nanocrystals, CNCs）这类生物基材料，虽然被认为比合成纳米材料更具生物相容性，但其纤维状结构和高长径比特征与已知具有肺毒性的碳纳米管相似，这引发了对其吸入安全性的深入思考。

目前的研究存在几个关键问题：首先，不同制备方法（如TEMPO氧化法和机械原纤化法）得到的NC在理化性质上存在显著差异，这些差异如何影响其生物效应尚不明确。其次，NC在肺部的滞留时间较长且生物降解性有限，可能导致持续的免疫激活。此外，表面化学修饰（如硫酸水解和脱硫处理）对NC毒性的影响机制仍需系统研究。更重要的是，现有研究缺乏与经典纳米毒理学参考材料（如多壁碳纳米管MWCNTs）的直接比较，难以准确评估NC的相对危险性。

为了解决这些知识空白，日本国家先进工业科学技术研究所（AIST）安全可持续性科学研究中心的Katsuhide Fujita团队在《Current Research in Toxicology》上发表了最新研究成果。研究人员采用整合方法，通过体内外实验模型全面评估了CNFs和CNCs的肺毒性和免疫毒性潜力。具体而言，在大鼠气管内滴注这些NC材料28天后，评估了肺部炎症、组织病理学变化和免疫反应；同时利用NR8383大鼠肺泡巨噬细胞进行体外分析，评估了CNC诱导的细胞毒性、炎性细胞因子产生、形态改变和基因表达变化。

研究采用的关键技术方法包括：1）通过透射电镜（TEM）和动态光散射（DLS）对材料进行物理化学表征；2）建立大鼠气管滴注模型进行体内毒性评估；3）支气管肺泡灌洗液（BALF）分析检测炎症标志物；4）流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析；5）体外细胞毒性检测（WST-1法）；6）多重免疫磁珠检测技术分析细胞因子谱；7）全基因组微阵列进行转录组学分析。研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠，所有动物实验均遵循ARRIVE指南和3R原则。

3.1. 测试材料的表征

TEM分析显示NC材料存在明显的形态差异：CNFs呈现高长径比的纤维状结构，而CNCs则表现为较短的纤维状晶体。MWCNTs呈现弯曲的多壁管状形态，与NCs明显不同。CNF1和CNF2的几何平均长径比均为78.0，而CNC1、CNC2和CNC3的长径比较低（22.4-30.6），MWCNTs的长径比最高（89.7）。zeta电位分析表明，CNF1（-63.2mV）比CNF2（-21.1mV）具有更高的负电荷，这可能是由于TEMPO氧化引入了羧酸盐基团。微生物污染分析显示CNF2、CNC2和CNC3存在不同程度的细菌污染，其中CNF2的内毒素水平最高（171.4 EU/mL）。

3.2. NC滴注后动物的总体状况

CNF2组在滴注后立即观察到一只动物出现呼吸不规则（麻醉苏醒时），但24小时内完全恢复。体重监测显示，CNF2组在滴注后第1天体重显著下降，但这种差异很快消失。第28天时，MWCNT组右肺重量显著增加，而NCs组未见显著变化。肝脏重量在各组间无显著差异。

3.3. 大体解剖和组织病理学发现

肺部宏观检查显示，对照组、CNF1和CNF2组未见明显异常，CNC1组一只动物出现红色变色，MWCNT组所有动物均出现黑色斑块。组织病理学评估显示，CNF1组所有动物均检测到肺泡巨噬细胞内的测试物质沉积，伴有肺泡巨噬细胞数量增加。CNF2组所有动物均出现终末细支气管中的测试物质沉积和肉芽肿形成。CNC1组未见测试物质沉积，但所有动物均显示肺泡巨噬细胞数量增加。MWCNT组所有动物均出现明显的测试物质沉积、肺泡巨噬细胞数量增加、变性和坏死。

3.4. BALF中的生化和细胞学分析

BALF分析显示，CNF1组总蛋白水平显著升高，MWCNT组升高更为明显。LDH活性在CNF1和CNC1组显著升高，MWCNT组升高最显著。细胞分析显示，CNF1暴露显著增加总白细胞计数，MWCNT组增加最为明显。中性粒细胞在CNC1组轻微增加，MWCNT组显著增加。细胞因子分析显示，MWCNT暴露诱导最显著的炎症反应，显著增加IL-1α、MIP-1α、IL-1β、MCP-1和SPP1水平。CNF1和CNC1暴露促进MIP-1α和IL-18增加，表明轻微的炎症激活。

3.5. 大鼠肺泡巨噬细胞对CNFs、CNC和MWCNTs的摄取

TEM证实了CNFs、CNCs和MWCNTs的细胞内定位和形态特征。CNF1处理的细胞中，CNFs出现在空泡样隔室内的精细纤维网络中；CNF2形成聚集或束状结构；CNC1处理的细胞中CNCs呈聚集或团聚状；MWCNT处理的细胞中可见弯曲结构 inside巨噬细胞。

3.6. 大鼠肺淋巴细胞亚群的流式细胞术分析

脾脏和胸腺的淋巴细胞亚群分析显示，CNFs或CNCs暴露未引起显著的全身免疫毒性，仅CNF1组NK细胞轻微增加。这些发现表明免疫系统干扰极小，进一步支持了它们相对较低的免疫毒性。

3.7. CNCs暴露对细胞活力的影响

CNCs在浓度高达100μg/mL时对NR8383细胞显示最小细胞毒性，24小时暴露后细胞活力接近或略高于100%。100μg/mL CNC3在48小时暴露后引起显著降低（74.9%），显示时间依赖性细胞毒性效应。

3.8. CNC暴露诱导的促炎细胞因子释放

NR8383细胞暴露于100μg/mL CNC导致促炎细胞因子呈时间和材料依赖性增加。24小时暴露时，CNC1诱导IL-6、MCP-1、MIP-1α和TNFα水平显著升高，而CNC2和CNC3诱导更广泛的细胞因子升高。48小时后，所有CNCs均显著增加IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-18、MCP-1、MIP-1α和TNFα水平，其中CNC2组反应最强。

3.9. 培养巨噬细胞的形态变化和CNCs的细胞内摄取

TEM成像证实了NR8383细胞在暴露于100μg/mL CNC1 24小时后对CNC1的细胞内摄取。对照组细胞保持完整形态，细胞器明确，无可检测的外来物质。相反，暴露于CNC1的细胞在空泡样隔室内出现电子致密颗粒，表明发生了内化作用。

3.10. 综合基因表达分析

CNC暴露上调了与炎症反应（Arg1、Ccl2、Ccl3等）、氧化应激（Hmox1、Sod2等）、凋亡（Casp1）和ECM降解（Mmp3、Mmp9等）相关的基因。其中CNC2通常引起最强烈的效应，表明触发炎症和氧化应激反应的潜力更高。

研究结论表明，NC材料的生物学效应强烈受纤维形态、表面特性和沉积行为调节。虽然NCs通常表现出比MWCNTs更低的肺毒性，但其表面化学特性显著影响免疫激活和细胞反应。特别是CNC2和CNC3在巨噬细胞中引起更强的细胞因子产生和氧化应激，强调了表面修饰在毒性表现中的关键作用。

讨论部分强调了几个重要观点：首先，纤维形态是NC肺毒性的关键决定因素，精细原纤化的CNF1仅引起轻度炎症反应，而较粗的CNF2则导致局部肉芽肿形成。其次，表面化学特性显著影响CNCs的细胞毒性，硫酸水解得到的CNC2因其高负表面电荷和增强的胶体稳定性可能促进细胞摄取并引发更强的炎症反应。此外，微生物和内毒素污染可能混淆毒性评估结果，强调需要仔细量化和解释。

这项研究的重要意义在于为NC安全评估提供了全面框架，强调需要针对特定材料的毒性评估和标准化评估框架。研究发现表明，不能将NCs视为统一的材料类别，而应根据物理化学属性和潜在污染物单独评估其生物效应。为确保职业和消费环境中的安全使用，未来研究应纳入长期和重复暴露模型、机制研究以及严格的内毒素控制。特别是对于生物降解性差和肺部滞留时间长的NC变体，需要逐案进行安全性评估。

该研究还指出了实际应用中的指导意义：由于某些NC材料的炎症潜力，需要采取适当的职业健康措施确保工人安全，包括工程控制、个人防护设备、常规环境监测和暴露人员健康监测。虽然尚未建立NC的具体职业接触限值，但NIOSH、OSHA和ECHA等其他纳米材料的现有指南提供了有用的监管框架。这些发现支持需要根据NC的独特特性制定物质特异性接触限值。