利用强启动子Pkan提高Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97菌株的苯乳酸产量

《Food Bioscience》：Improving Phenyllactic Acid Production of Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97 Using a Strong Promoter, P kan

苯丙乳酸合成菌选育及代谢调控研究。从醋糟中分离的醋酸菌Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97具有苯丙乳酸合成能力，通过筛选强启动子Pkan并过表达aroC、pheA、gdh、fdh基因，显著提升其PLA产量至原菌的113%-140.2%。研究为构建高效PLA工程菌株提供新思路。

　　本研究围绕一种名为苯甲酸（Phenyllactic acid, PLA）的广谱抗菌物质展开，探讨其在食品工业中的应用潜力。PLA是一种广泛存在于食品中的天然成分，尤其是在发酵食品如泡菜、奶酪和酸面包中较为常见。其抗菌特性不仅对多种病原菌有效，如大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌，还能抑制如青霉菌、曲霉菌和镰刀菌等病原真菌的生长。此外，PLA具有良好的水溶性、热稳定性和广泛的pH范围适应性，这些特性使其在食品和饲料工业中展现出巨大的应用前景。

PLA的生产途径主要有三种：化学合成、植物提取和微生物生物合成。然而，化学合成和植物提取方法存在诸多挑战，例如高能耗、副产物生成以及植物原料的供应限制等。因此，微生物生物合成方法逐渐成为一种更环保、更经济的替代方案。目前已发现多种微生物能够产生PLA，包括乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LABs）如植物乳杆菌、发酵乳杆菌和饲料乳杆菌，以及一些非LAB菌株如醋酸杆菌（Acetic Acid Bacteria, AABs）中的Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97菌株。尽管如此，通过直接微生物发酵获得的PLA产量仍然较低，因此需要对PLA的生物合成途径进行改造和优化，以提高其产量。

本研究的重点是利用Gluconacetobacter tumulisoli FBFS 97菌株，通过筛选和优化关键基因的表达来提高PLA的产量。该菌株是首个被报道能够合成PLA的AAB菌株，其在食品工业中的应用潜力尚未被充分开发。为了提高PLA的产量，研究团队首先筛选出一种适用于该菌株的强启动子——Pkan（链霉素抗性基因启动子）。通过使用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）作为报告基因，研究团队从五个候选启动子中（包括gluconate 2-dehydrogenase启动子Pga2dh、quinoprotein glucose dehydrogenase启动子Pgdh3、NADH dehydrogenase启动子Pndh、HTH-type transcriptional repressor启动子Pnics）筛选出Pkan启动子，该启动子在提升基因表达方面表现出较高的效率。

随后，研究团队对与PLA生物合成相关的五个关键基因进行了过表达实验。这些基因包括：色氨酸合成酶基因aroC、前苯丙氨酸脱水酶基因pheA、葡萄糖脱氢酶基因gdh、甲酸脱氢酶基因fdh以及甘油酸脱氢酶基因gldh。通过使用Pkan启动子分别调控这些基因的表达，研究团队发现除了gldh过表达菌株外，其他四个突变菌株的PLA产量分别提高了125.9%、140.2%、130%和113%。这一结果表明，通过优化启动子和关键基因的表达，可以显著提升PLA的产量，从而为构建高产PLA工程菌株奠定基础。

PLA的生物合成途径主要分为两种：从头合成途径（de novo biosynthetic pathway）和核心合成途径（core synthesis pathway）。从头合成途径主要依赖葡萄糖作为底物，通过糖酵解或戊糖磷酸途径生成3-脱氧-D-阿拉伯糖酮酸-7-磷酸，随后通过色氨酸合成酶AroC和双功能酶色氨酸变位酶-前苯丙氨酸脱水酶PheA将其转化为前苯丙氨酸（Prephenate），再进一步脱水生成苯丙酮酸（Phenylpyruvate, PPA），最后在乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）的作用下，利用辅酶NADH将其还原为PLA。而核心合成途径则主要涉及两个步骤：首先，苯丙氨酸（Phenylalanine, Phe）通过转氨酶（Aromatic Amino Acid Transferase, AraT）转化为PPA，再由LDH还原为PLA。两种途径在PLA的合成过程中各具特点，但从头合成途径需要更多的辅酶支持，而核心合成途径则相对更高效。

在当前研究中，团队基于核心合成途径，通过同时或分别表达芳香氨基酸转移酶基因arat和乳酸脱氢酶基因ldh，显著提高了PLA的产量。同时，利用苯丙氨酸或PPA作为底物，以及NADH作为辅酶，进一步优化了合成过程。然而，NADH、PPA和苯丙氨酸等辅酶和底物成本较高，限制了该方法的广泛应用。因此，研究团队尝试通过过表达从头合成途径中的关键基因（如aroG和pheA），并利用Pkan启动子进行调控，以实现PLA的高效生产。这一方法利用葡萄糖作为廉价的底物，通过提高相关基因的表达水平，有效提升了PLA的产量。

此外，研究团队还对PLA生物合成途径中的辅酶再生相关基因进行了过表达实验，包括甲酸脱氢酶基因fdh、葡萄糖脱氢酶基因gdh以及甘油酸脱氢酶基因gldh。这些基因在PLA合成过程中的作用是提供足够的辅酶NADH，从而支持PLA的生物合成反应。通过提高这些基因的表达水平，可以有效提升PLA的产量。研究结果表明，所有过表达菌株的PLA产量均较原始菌株有所提高，其中部分菌株的产量显著增加，达到了接近80 mg/L的水平。这一成果为PLA的高效生产提供了新的思路和方法。

在实验过程中，研究团队采用了一系列生物技术和分子生物学手段。首先，通过基因工程技术构建了重组载体，利用pKOS6b和pCAMBIA3300-EGFP等质粒作为工具，对Pkan启动子进行筛选和验证。随后，通过基因克隆和表达技术，将关键基因导入菌株中，并在合适的培养条件下进行表达和发酵。实验结果表明，Pkan启动子在提高基因表达方面具有显著优势，而关键基因的过表达则进一步提升了PLA的产量。这些实验不仅验证了Pkan启动子的有效性，还展示了关键基因在PLA合成过程中的重要作用。

此外，研究团队还对PLA的生物合成途径进行了深入分析。通过对相关基因的功能和表达水平的研究，团队发现PLA的合成过程涉及多个步骤和多个酶的协同作用。其中，某些关键基因的过表达能够显著提升PLA的产量，而某些基因的表达水平则对PLA的合成具有一定的限制作用。因此，通过优化这些基因的表达水平，可以进一步提高PLA的产量。同时，研究团队还对辅酶再生过程进行了分析，发现辅酶NADH的供应对PLA的合成具有重要影响，因此通过提高辅酶再生相关基因的表达水平，可以有效提升PLA的产量。

在实验过程中，研究团队还对培养条件进行了优化。通过调整培养基的成分、温度、pH值和氧气供应等参数，团队发现这些因素对PLA的产量具有显著影响。例如，较高的温度和适当的pH值能够促进菌株的生长和代谢，从而提高PLA的产量。此外，适当的氧气供应能够促进菌株的氧化发酵，从而提高PLA的合成效率。这些优化措施为PLA的高效生产提供了重要的技术支持。

本研究的成果不仅为构建高产PLA工程菌株提供了基础，还为PLA的生物合成途径研究提供了新的视角。通过筛选和优化启动子，以及过表达关键基因，团队发现这些措施能够显著提升PLA的产量。此外，辅酶再生相关基因的过表达也为PLA的合成提供了新的思路。这些研究结果表明，PLA的合成过程可以通过多种方式进行优化，从而实现更高的产量和更广的应用前景。

在实际应用中，PLA作为一种天然抗菌物质，具有广泛的应用潜力。例如，在食品工业中，PLA可以作为天然防腐剂，用于延长食品的保质期和提高食品的安全性。此外，PLA还具有良好的水溶性和热稳定性，适用于多种食品加工工艺。然而，目前PLA的产量仍然较低，因此需要进一步优化其生物合成途径，以提高产量并降低成本。本研究通过筛选和优化启动子，以及过表达关键基因，为PLA的高效生产提供了重要的技术支持。

未来，PLA的生产研究可能会朝着更高效、更环保的方向发展。例如，通过合成生物学手段，构建更高效的PLA合成途径，利用更廉价的底物和辅酶，提高PLA的产量。此外，还可以通过优化培养条件和代谢调控策略，进一步提升PLA的产量和纯度。这些研究方向将有助于PLA在食品工业中的广泛应用，同时也为其他抗菌物质的生产研究提供了借鉴。

总之，本研究通过筛选和优化启动子，以及过表达关键基因，显著提高了PLA的产量。这些成果不仅为构建高产PLA工程菌株提供了基础，还为PLA的生物合成途径研究提供了新的思路。随着相关技术的不断进步，PLA的生产效率和应用前景将进一步提高，为食品工业的发展做出更大的贡献。