CLCA4通过调控vimentin-FAK信号轴抑制结直肠癌干细胞自我更新并增强抗PD-1免疫治疗疗效的机制研究

本研究针对结直肠癌（CRC）中癌症干细胞（CSCs）介导的治疗抵抗和免疫逃逸难题，揭示了氯通道辅助蛋白4（CLCA4）在CD133+CD44+ CSCs中显著低表达的现象。研究人员通过功能实验证实CLCA4过表达可抑制干细胞标志物（Bmi-1、Oct4、ABCG2）表达、降低肿瘤球形成能力，并通过与波形蛋白（vimentin）相互作用抑制FAK信号通路。动物实验表明CLCA4过表达联合抗PD-1治疗显著增强CD8+ T细胞浸润并抑制肝转移。该研究为CLCA4作为CRC免疫治疗增敏靶点提供了理论依据。

　　

结直肠癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，每年新增病例超过180万，死亡人数高达88万。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率近几十年来快速上升，已成为重大公共卫生问题。尽管结直肠癌的诊断和治疗手段取得了显著进步，但患者的预后仍然较差，尤其是晚期患者。肿瘤术后复发和转移是治疗反应和长期生存的主要障碍。

近年来，癌症干细胞（CSCs）理论的提出为理解结直肠癌的治疗抵抗和复发提供了新视角。CSCs是一类具有干细胞特性的癌细胞亚群，具有无限自我更新和分化能力，并增强侵袭正常组织和逃避免疫监视的能力。因此，阐明调控结直肠癌干细胞特性的分子决定因素和信号通路，对于开发有效的靶向治疗至关重要。

钙激活氯通道调节剂（CLCA）家族是一类自切割分泌蛋白，调节钙依赖性氯电流。某些CLCA成员的异常表达在多种癌症类型中均有观察到，表明它们可能在肿瘤发生中发挥作用。其中，CLCA4作为一种钙激活氯通道调节蛋白，与结直肠癌和肝细胞癌等多种癌症的发展相关。CLCA4的下调或突变可能影响肿瘤进展。然而，CLCA4在结直肠癌干细胞中的机制作用仍不清楚。

与此同时，免疫检查点阻断抗体的引入代表了多种恶性肿瘤治疗的重大进展。针对程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）的抗体在某些患者群体中显示出显著的临床益处，为结直肠癌治疗带来了新的希望。然而，尽管取得了这些进展，最近的临床前研究表明，免疫检查点阻断单药治疗在结直肠癌中的效果并不如预期。这促使人们探索将免疫检查点阻断与其他治疗方式结合的联合治疗策略。此外，越来越多的证据表明，免疫治疗可能导致具有CSC特性的肿瘤细胞富集，可能促进适应性抵抗和疾病复发。

因此，探究CLCA4在调节结直肠癌干细胞特性中的作用及其增强免疫治疗效果的潜力，具有重要的科学意义和临床价值。发表在《Genes》上的这项研究，正是针对这一科学问题开展的深入探索。

为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法：使用CD133和CD44抗体通过流式细胞术分选CRC干细胞；建立5-氟尿嘧啶和顺铂耐药细胞株；通过慢病毒转染构建稳定过表达CLCA4的细胞系；采用肿瘤球形成实验评估干细胞自我更新能力；通过Transwell和Boyden小室实验分析细胞迁移和侵袭；利用免疫共沉淀和质谱分析鉴定CLCA4相互作用蛋白；使用GST pull-down验证蛋白直接相互作用；通过裸鼠成瘤实验和肝转移模型进行体内功能验证；采用免疫组化和免疫荧光分析临床样本和小鼠肿瘤组织。研究纳入了20对CRC和癌旁组织以及100例CRC临床样本进行相关分析。

研究结果方面：

CLCA4在结直肠癌干细胞和耐药细胞中表达降低

研究人员发现CLCA4在癌症组织中普遍低表达，且与较大肿瘤、转移和不良生存结果相关。在富含CSC的肿瘤球中，CLCA4表达显著低于传统单层培养细胞。在表达CSC标志物CD133和CD44的CRC细胞群（CD133⁺/CD44⁺）中，CLCA4显著降低。在5-氟尿嘧啶和顺铂耐药的SW480细胞中，CLCA4表达也明显减少，而干性相关基因（Bmi-1、ABCG2和Oct4）的mRNA水平显著升高。

异位表达CLCA4降低CRC细胞的增殖、侵袭和运动能力

建立稳定过表达CLCA4的CRC细胞后，CCK8和集落形成实验显示CLCA4过表达显著降低细胞活力和集落形成能力。Transwell和Boyden小室实验表明CLCA4过表达细胞的迁移和侵袭能力显著降低。定量PCR和Western blotting显示异位CLCA4表达显著增加上皮标志物E-cadherin表达，降低间质标志物vimentin表达。

异位表达CLCA4降低CRC细胞的干细胞样特性

与对照组相比，CLCA4过表达细胞中干性基因（Oct4、ABCG2和Bmi-1）表达显著降低。肿瘤球形成实验显示CLCA4过表达细胞形成的肿瘤球数量减少，表明CLCA4抑制结直肠癌干细胞的自我更新并减少其群体大小。

CLCA4降低体内肿瘤起始细胞数量

极限稀释实验显示，CLCA4过表达显著抑制肿瘤生长动力学。接种5×10⁵或5×10⁴个细胞时，CLCA4过表达细胞首次可触及肿瘤的出现时间比对照组晚6天。19-37天后，CLCA4过表达肿瘤明显小于对照组。免疫组化或Western blotting分析显示CLCA4过表达异种移植瘤中Ki67、Oct4和Bmi-1表达降低。

CLCA4通过下调FAK介导的信号通路抑制结直肠癌干细胞扩增

RNA测序和Western blotting分析发现CLCA4过表达抑制FAK信号通路。使用FAK激动剂处理后，p-FAK表达上调，干性相关蛋白表达部分恢复，肿瘤球数量增加，表明FAK信号通路介导了CLCA4低表达对CRC干细胞维持能力的影响。

Vimentin对CLCA4在结直肠癌干细胞扩增中的功能至关重要

质谱分析鉴定出336个与CLCA4相互作用的差异表达蛋白，其中vimentin被选为候选的CLCA4相互作用蛋白。免疫共沉淀实验证实了CLCA4和vimentin之间的相互相互作用。GST pull-down实验证明CLCA4在体外直接与vimentin相互作用。vimentin过表达增加干性相关标志物表达，促进肿瘤球形成，并提高p-FAK蛋白表达，这些效应与CLCA4过表达相反。异位表达vimentin逆转了CLCA4诱导的干性相关标志物下调、p-FAK表达抑制和肿瘤球形成抑制。

CLCA4表达与CRC中干细胞相关标志物表达呈负相关

与正常样本相比，CRC组织中CLCA4表达下调，干性标志物表达上调。CLCA4表达与Bmi-1、Oct4和vimentin水平呈负相关。100例CRC活检组织的免疫组化显示，CLCA4蛋白表达降低与Bmi-1、Oct4和vimentin升高相关。

CLCA4过表达增强抗PD-1的治疗效果

CLCA4介导的CRC细胞干性转化下降显著重塑肿瘤微环境至抗肿瘤状态，肿瘤内CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞显著浸润。动物实验表明，p-CLCA4和抗PD-1联合治疗显著减小肿瘤体积和重量，减缓肿瘤生长。在CT-26肝转移模型中，联合治疗比单药治疗更显著抑制肝转移。免疫荧光和免疫组化染色显示联合治疗组CD8⁺ T细胞浸润显著增加，分泌颗粒酶GZMB和穿孔素的CD8⁺ T细胞比例显著上升，Ki67所示的肿瘤细胞增殖减少，肿瘤组织中的干性转化显著减弱。

研究结论和讨论部分强调，本研究为CLCA4在CRC中的肿瘤抑制作用和临床管理治疗的潜在意义提供了有力证据。CLCA4表达减少在CRC组织中普遍存在，与侵袭性表型相关，包括晚期肿瘤分期、侵袭和转移。重要的是，CLCA4表达降低与不良预后结果显著相关，强调了CLCA4作为CRC预后标志物的潜在效用。

研究阐明了CLCA4在CRC中的机制基础，及其对CSC特性和肿瘤起始能力的抑制作用。CLCA4过表达导致干性标志物表达降低，抑制肿瘤球形成和体内致瘤性，表明CLCA4是CRC干性和致瘤潜能的潜在调节因子。

CLCA4作为结直肠CSC的关键调节因子，通过抑制FAK信号通路发挥作用，这对癌细胞生存和增殖至关重要。CLCA4过表达对FAK通路的负面影响对于降低CSC特性至关重要，FAK激动剂可逆转这些效应。Vimentin是CLCA4调节功能中的重要中介，免疫共沉淀研究证实了它们的相互作用，并表明其对CSC自我更新的影响。

此外，CSCs已知在肿瘤微环境内启动和维持特定的免疫细胞群，包括肿瘤相关巨噬细胞和调节性T细胞，这些细胞有助于免疫抑制状态，促进免疫逃逸。有效靶向CSCs有可能重新配置其周围微环境，从而提高免疫治疗策略的有效性。本研究使用微卫星稳定CRC小鼠模型评估CLCA4调节和抗PD-1免疫治疗的协同作用。通过CLCA4靶向战略性降低干性特性显著改善了对抗PD-1治疗的反应。CLCA4通过分泌趋化因子CXCL10促进CD8⁺ T细胞浸润，并通过上调免疫激活通路（BCR、TCR、细胞因子和TNF）和下调TGF-β信号，将肿瘤微环境从免疫抑制转变为免疫刺激，增强免疫治疗效果。

总之，本研究探索了CLCA4在CRC中的肿瘤抑制作用及其作为治疗靶点的潜力。CLCA4下调使CRC细胞具有侵袭性表型和化疗抵抗，而其上调抑制CRC细胞的干细胞样特性。CLCA4与vimentin相互作用，调节FAK信号和CSC维持。CLCA4表达增强抗PD-1的治疗效果。因此，调节CRC干性可以重塑肿瘤免疫微环境并改善免疫治疗，从而为未来研究CLCA4在CRC管理中的临床应用奠定基础。