靶向叶酸受体α（FOLR1）的CAR-T细胞在骨肉瘤临床前研究中展现高效抗肿瘤活性

本刊推荐：本研究深入探讨了靶向叶酸受体α（Folate Receptor-α, FOLR1）的CAR-T细胞（FH FOLR1-CART）在治疗难治性骨肉瘤中的潜力。通过多组学数据证实FOLR1在骨肉瘤中广泛高表达，体外及体内实验（包括细胞系衍生异种移植CDX和患者来源异种移植PDX模型）均证明该CAR-T细胞能高效清除肿瘤并实现完全缓解。研究为晚期骨肉瘤患者提供了新的治疗策略，目前相关临床试验（NCT06609928）已在推进中。

　　

Abstract

转移性和复发性骨肉瘤即使在先进外科技术、强化化疗和靶向治疗的时代仍难以治愈。嵌合抗原受体（CAR）T细胞等过继性免疫疗法虽处于发展初期，但对侵袭性实体瘤如骨肉瘤患者仍是一种可行的治疗策略。叶酸受体α（FOLR1）在骨肉瘤病理生理中具有功能相关性，因此成为潜在治疗靶点。研究团队近期将一种FOLR1特异性CAR-T细胞产品（FH FOLR1-CART）推进至婴儿急性髓系白血病（AML）试验（NCT06609928），并进一步评估其在骨肉瘤中的应用。

研究提供了骨肉瘤患者样本、细胞系和患者来源异种移植（PDX）中全面的FOLR1转录本和蛋白表达谱，证实其作为治疗靶点的重要性。团队在标准及患者来源的骨肉瘤细胞系和异种移植模型中评估了FH FOLR1-CART的体外和体内疗效。结果显示，FOLR1转录本在绝大多数骨肉瘤原发患者样本、细胞系和患者来源模型中均有表达。FH FOLR1-CART在体外表现出强大的激活能力和对表达FOLR1的骨肉瘤细胞系及原代样本的有效细胞毒性。更重要的是，在局部和转移性体内细胞衍生及患者来源异种移植模型中，FH FOLR1-CART显示出强大的抗肿瘤活性，可实现肿瘤完全清除。这些结果为晚期骨肉瘤患者提供了一种潜在治疗选择。目前，FH FOLR1-CART正在Fred Hutchinson癌症中心和Seattle儿童医院推进针对复发/难治性骨肉瘤的早期临床试验。

Introduction

骨肉瘤仍是一种难治性疾病，转移性 setting 下的5年总生存（OS）率估计低于30%，复发或难治性患者的生存率更低。过去三十年的临床试验未能通过化疗强化或靶向治疗的添加改善预后。用于实体瘤的CAR-T细胞等过继性细胞疗法虽处于发展初期，但正在积极研究中。鉴于这些疗法的新颖性及靶向脱瘤副作用的风险，当前多数研究聚焦于描述针对GD2、B7-H3、叶酸受体、EGFR、HER2和GPC3等抗原的细胞产品的安全性。

FOLR1是一种细胞膜上的叶酸结合蛋白，正常在脉络丛、甲状腺、唾液腺、乳腺、结肠、膀胱、肺肺泡和肾近曲小管低水平表达。在恶性转化背景下，FOLR1在多种实体瘤如肺、乳腺、卵巢和胃癌中过度表达，并与更侵袭性肿瘤行为及放化疗反应差相关。因此，FOLR1靶向治疗正在这些恶性肿瘤中研究，许多研究聚焦于卵巢癌。

FOLR1在治疗耐药骨肉瘤中的作用已有描述。尽管FOLR1在骨肉瘤中的具体角色尚未明确，但有证据表明其以低于还原叶酸载体（介导甲氨蝶呤摄取的主要受体）的浓度梯度摄取叶酸。此外，Yang等从107例骨肉瘤患者样本生成PDX模型，其中84例（78.5%）检测到FOLR1 mRNA表达，部分达到卵巢癌细胞系的表达水平，表明该通路是肿瘤细胞叶酸摄取的替代途径，促进肿瘤生长。

研究团队最近发现在由CBFA2T3::GLIS2融合驱动的高度难治性婴儿AML中FOLR1表达。为靶向该AML，团队使用farletuzumab的单链可变片段（scFv）、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ细胞毒性域开发了FOLR1特异性CAR-T产品（FH FOLR1-CART）。FH FOLR1-CART在FOLR1阳性AML模型中表现出强大的抗白血病活性，且无造血毒性。该CAR-T产品目前正在复发/难治性CBFA2T3-GLIS2 AML的1期临床试验（NCT06609928）中研究。为拓展FH FOLR1-CART用于其他难治恶性肿瘤，团队提供了其在骨肉瘤中活性的有力体外和体内证据。

Materials and Methods

Tumor mRNA expression profiling

从St. Jude Cloud获取2,358例各种恶性肿瘤患者样本的全基因组测序数据。从Open Pediatric Cancer Project v15下载34,138例各种恶性肿瘤患者样本的RNA测序表达数据，并从儿科临床前测试联盟（现称儿科临床前体内测试联盟PIVOT）获取244例样本。标准化读取计数（FPKM）转换为TPM，所有转换在R（v4.3.2）中进行。

Primary tumor cells

U-2 OS骨肉瘤细胞系由Dr. Stanley Lee馈赠，培养于DMEM加10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素。细胞定期检测支原体污染，细胞身份通过CLA IdentiFiler Plus PCR扩增试剂盒验证。患者来源细胞系OS766、OS742、OS186、OS457和OS525由Dr. E. Alejandro Sweet-Cordero馈赠。PDX肿瘤细胞系OS9和OS33由Dr. R. Gorlick馈赠。

Lentiviral production and transduction of T cells

FOLR1-CAR T细胞的生成如前所述：用携带FOLR1 CAR载体（scFv源自farletuzumab，含中等长度IgG4 spacer、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ细胞毒性域）的慢病毒转导健康供体T细胞。添加截短CD19作为转导标记。转导细胞通过抗人CD19微珠分选，分选后在含IL-2的CTL培养基中扩增，用于体外和体内细胞毒性试验。

Flow cytometry

用抗FOLR1-PE确认U-2 OS和患者来源细胞的FOLR1表达。T细胞的免疫表型用抗CD45-BUV805、抗CD3-BUV395、抗CD4-BV605、抗CD8-BV711和抗CD19-APC-eFluor780确认。使用BD Symphony II流式细胞仪和FlowJo软件分析。

In vitro cytotoxicity assay by flow cytometry

将2.5×10⁴ U-2 OS细胞与CD8⁺ T细胞以效应器与靶标（E:T）比率1:1、2:1、5:1和10:1共培养6和24小时，用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit染色分析。患者来源细胞系以类似方法测试。

Luminex

共培养24小时后收集上清液，用Human Luminex Assay量化IL-2、IFN-γ和TNFα。

IncuCyte

用表达eGFP的U-2 OS细胞与CD8⁺ T细胞共培养，每30分钟采集图像24小时，添加IncuCyte Cytotox Red Reagent检测死细胞。

In vivo studies

使用NOD/SCID/γc^?/? (NSG)小鼠，通过股骨内接种1×10⁶ U-2 OS细胞建立局部疾病，尾静脉注射建立转移性肺病。肿瘤植入后14天尾静脉注射5×10⁶ FOLR1-CAR或未转导（NT）T细胞。PDX模型通过尾静脉注射1×10⁶ PDX来源细胞建立。通过IVIS成像监测疾病进展，组织收获后分析。

Peripheral T-cell collection and detection

通过眶后采血收集外周血，用红细胞裂解缓冲液处理，流式细胞术免疫表型分析。

MRI imaging

使用临床前MR扫描仪评估肿瘤大小和进展，小鼠麻醉后采用快速自旋回波T2加权和T1加权扫描。

CT imaging

使用呼吸门控高速微CT获取3D数据集，参数为90 kV管电压、88 μA管电流、36 mm视野、72 μm体素大小，扫描时间4分钟/小鼠。

Histopathology

肺组织用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片4-5 μm，H&E染色，由 board-certified veterinary pathologist 检查。

Statistical analysis

使用未配对双尾Student t检验确定体外研究统计学显著性，Kaplan-Meier生存曲线用log-rank (Mantel-Cox)检验比较，P<0.05为显著。

Study approval

实验经FHCC机构动物护理和使用委员会批准（协议51068），并遵循机构和国家级指南和法规。研究经FHCC机构审查委员会批准（协议9950），符合赫尔辛基宣言。

Results

FOLR1 mRNA expression in osteosarcoma

从St. Jude儿科癌症基因组计划（PCGP）获取的原发患者病例数据显示，多数骨肉瘤样本有FOLR1表达，中位FPKM为5.614（n=113；范围0-84.12）。其他表达FOLR1 mRNA的肿瘤类型包括室管膜瘤、脉络丛癌和AML。PIVOT和Open Pediatric Cancer Project v15数据进一步证实了这一发现，骨肉瘤样本中位TPM分别为10.448和12.54。正常组织中FOLR1表达有限，仅见于甲状腺、肾小管上皮和肺上皮。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against the FOLR1-positive osteosarcoma cell line U-2 OS in vitro

U-2 OS显示高FOLR1表面表达（MFI 7,972，较同型对照增加58.2倍）。FH FOLR1-CART在E:T比率1:1至10:1下表现出强大的靶向特异性细胞毒性，6小时和24小时肿瘤细胞裂解率分别达76.5%-97.4%和95.5%-99%，而NT T细胞仅引起23.8%-45.7%和26.1%-44.8%裂解。活细胞成像显示与FH FOLR1-CART共培养后肿瘤细胞死亡，而与NT T细胞共培养的肿瘤继续生长。共培养上清液中检测到促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα，证实CAR-T细胞激活。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against a FOLR1-positive osteosarcoma cell line–derived xenograft model in vivo

在局部U-2 OS CDX模型中，接受NT T细胞的小鼠（n=2）疾病进展，IVIS平均辐射增加，90天内死亡；而接受FH FOLR1-CART的小鼠（n=2）肿瘤清除，疾病控制维持，190天OS率100%。MRI显示NT组小鼠股骨周围软组织肿块和骨破坏，而CART组无肿瘤生长或骨破坏。在转移性U-2 OS模型中，NT组（n=3）疾病进展，190天内全部死亡；CART组（n=3）OS改善至190天。CT显示NT组肺部结节状空气空间混浊，CART组肺部正常。组织学检查证实CART组无疾病，而NT组有肺骨肉瘤。

FH FOLR1-CART exhibits antitumor activity against patient-derived osteosarcoma in vitro and in vivo

七例患者来源骨肉瘤模型中的五例显示高FOLR1表面表达（MFI 817-8,930，较同型对照增加4.3-159.5倍），两例（OS33和OS457）表达 minimal。FH FOLR1-CART对四例FOLR1阳性患者来源细胞系（OS186、OS525、OS766、OS742）在所有E:T比率下均表现出 potent cytotoxicity，对FOLR1阴性细胞系OS457无杀伤作用。共培养上清液中检测到细胞因子分泌，证实CAR-T细胞激活。在转移性PDX模型中，接受FH FOLR1-CART的小鼠疾病控制改善，180天OS率80%，而NT组为20%。IVIS成像显示CART组无肺病，组织学检查证实无疾病。

Discussion

过去四十年的随机试验未能改善骨肉瘤预后，高风险患者结局尤其差。CAR-T疗法发展受限于肿瘤特异性抗原的识别以减少脱瘤副作用。FOLR1因在肿瘤表面表达而在正常组织中低或不表达成为有吸引力的靶点。其在骨肉瘤中的功能生物学和潜在治疗耐药作用使其更具吸引力。

先前研究描述FOLR1在78.5%的患者来源骨肉瘤样本中过度表达，本研究通过多组学数据进一步证实大多数骨肉瘤患者样本有FOLR1 mRNA表达。尽管mRNA表达不与蛋白表达直接相关，但团队在多个患者来源骨肉瘤细胞系和肿瘤中验证了FOLR1表面表达。因此，骨肉瘤适合用FH FOLR1-CART靶向治疗。

本研究详细评估了FOLR1-CART在标准骨肉瘤细胞系和多个患者来源细胞系中的体外活性。体外肿瘤细胞杀伤显示抗原密度依赖性细胞毒性，FOLR1高表达细胞系中杀伤作用强。团队还完成了FH FOLR1-CART against CDX和PDX模型的体内治疗评估。尽管标准U-2 OS细胞系用作初步研究，但患者来源肿瘤细胞系OS9用于评估体内FH FOLR1-CART在转移模型中的活性。选择转移PDX模型因其临床相关性，表现为不可切除肺转移患者预后更差，更可能寻求手术切除外的替代治疗策略。使用U-2 OS和OS9的体内研究显示FH FOLR1-CART治疗后肿瘤消退和显著OS优势。

FH FOLR1-CART的scFv源自抗FOLR1人源化mAb farletuzumab（MORAb-003）。Farletuzumab据报道与FOLR1特异性高亲和力结合，导致卵巢癌细胞生长减少和补体介导细胞毒性增加。体内实验显示在局部和转移模型中 sustained tumor control，无显著副作用。小鼠体重和总体健康维持，无肿瘤生长迹象。然而，尚无 published preclinical data证明farletuzumab与小鼠生理FOLR1结合，因此这些数据可能不反映FH FOLR1-CART在人类受试者中的安全性。令人 reassurance的是，既往临床研究数据提供farletuzumab良好安全性 profile，不良反应限于1或2级。其他FOLR1靶向剂如FDA批准的mirvetuximab soravtansine也未显示脱瘤FOLR1靶向特异性毒性。因此，目前 little reason担忧显著脱瘤副作用。

团队决定使用基于farletuzumab的受体进行FH FOLR1-CART研究，因先前一代FOLR1-CAR（用 murine mAb MOv18的scFv构建）研究显示患者出现细胞因子释放综合征，T细胞持久性短，临床抗肿瘤反应有限。这可能部分 due to CAR-T细胞设计缺乏共刺激域，以及针对鼠源受体的免疫原性。团队通过使用人源化mAb和在FH FOLR1-CART设计中包含4-1BB共刺激域 address免疫原性问题。虽然 recognize小鼠和人类T细胞动力学存在差异，但团队证明FH FOLR1-CART与输注小鼠的NT T细胞相比 expansion，随后在CDX体内研究中第12天 contraction。该模式与实体瘤临床研究中CAR-T细胞动力学 published reports相似。在PDX体内研究中未检测到T细胞 expansion，团队 hypothesize可能 due to治疗时疾病负荷较低，以及FH FOLR1-CART可能 trafficking至活跃肿瘤部位。这与 lower disease burden setting中CD19-CART expansion的发现一致，不一定表明无效CAR-T细胞抗肿瘤活性。需要进一步工作通过利用实体瘤微环境的免疫调节障碍改善CAR-T细胞持久性。CAR-T细胞治疗后肿瘤样本的额外临床前研究将提供 insight改善临床反应的策略。未来策略可能包括添加工程化细胞因子释放以支持溶细胞活性，以及其他改善肿瘤对细胞疗法敏感性的策略。

FH FOLR1-CART目前正在针对FOLR阳性复发难治性儿科AML患者的1期剂量寻找临床研究（NCT06609928）中研究。等待进一步临床数据的同时，团队 look to expand该产品用于其他难治恶性肿瘤的适应症。临床前数据支持FH FOLR1-CART抗CDX和PDX骨肉瘤模型的抗肿瘤活性。因此，团队计划在针对FOLR1表达、化疗难治或不可切除转移性骨肉瘤患者的早期临床试验中扩展FH FOLR1-CART的临床评估。