靶向FOLR1的CAR-T细胞疗法在晚期骨肉瘤中的临床前研究：从体外杀伤到体内完全缓解的突破性证据

本刊重磅推荐：本研究首次系统证实叶酸受体α（FOLR1）在骨肉瘤中的广泛表达（78.5%），并开发了基于人源化单抗farletuzumab的FOLR1-CAR-T疗法（含CD28/4-1BB/CD3ζ结构域）。通过体外细胞毒性实验、细胞因子（IL-2/IFN-γ/TNFα）检测及多种体内模型（局部/转移性CDX/PDX）验证，该疗法展现出显著抗肿瘤活性与完全缓解效果，为晚期骨肉瘤患者提供了新的免疫治疗策略（NCT06609928临床试验进行中）。

　　

Abstract

转移性和复发性骨肉瘤尽管存在先进的手术技术、强化化疗和靶向治疗，仍然难以治疗。嵌合抗原受体（CAR）T细胞等过继性免疫疗法尚处于起步阶段，但对于侵袭性实体瘤（如骨肉瘤）患者仍是一种可行的治疗策略。叶酸受体α（FOLR1）在骨肉瘤病理生理学中具有功能相关性，为其作为潜在治疗靶点提供了理论依据。我们最近将一种FOLR1特异性CAR-T细胞产品（FH FOLR1-CART）推进至婴儿急性髓系白血病（AML）的试验（NCT06609928），并评估了该CAR构建体对骨肉瘤的疗效。我们提供了骨肉瘤患者、细胞系和患者来源异种移植（PDX）中全面的FOLR1转录本和蛋白表达谱，证实了其作为治疗靶点的重要性。我们进一步评估了FH FOLR1-CART在标准骨肉瘤细胞系和患者来源骨肉瘤细胞系以及异种移植模型中的体外和体内疗效。FOLR1转录本在绝大多数骨肉瘤原代患者标本、骨肉瘤细胞系和患者来源模型中均有表达。FH FOLR1-CART在体外对表达FOLR1的骨肉瘤细胞系和原代骨肉瘤患者样本表现出强大的激活作用和有效的细胞毒性。更重要的是，FH FOLR1-CART在局部和转移性体内细胞来源和患者来源的异种移植模型中均显示出强大的抗肿瘤活性，能够完全清除肿瘤。这些结果为晚期骨肉瘤患者提供了一个潜在的治疗选择。FH FOLR1-CART正在弗雷德·哈钦森癌症中心和西雅图儿童医院推进用于复发/难治性骨肉瘤的早期试验。

Introduction

骨肉瘤仍然是一种难以治疗的疾病，在转移性疾病背景下，其5年总生存率（OS）估计低于30%，对于复发或难治性疾病则更低。不幸的是，过去三十年中进行的先前试验未能证明通过强化化疗或添加靶向治疗可以改善结局。用于实体瘤的过继性细胞疗法，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞，正处于发展的初期阶段，但正在积极研究中。鉴于这些疗法的新颖性和靶向、脱瘤不良反应的风险，当前大多数研究侧重于描述针对GD2、B7-H3、叶酸、EGFR、HER2和GPC3等抗原的细胞产品的安全性。尽管这些产品的临床疗效尚不清楚，但最近在成人滑膜肉瘤患者中使用MAGE-A4特异性T细胞受体T细胞显示出足够的临床反应，导致了首个用于实体瘤的细胞疗法获得FDA批准。这一进展证明了在适当靶向背景下，细胞疗法治疗实体瘤的潜在成功。

叶酸受体α（FOLR1）是一种在细胞膜上表达的叶酸结合蛋白。它通常在脉络丛、甲状腺、唾液腺、乳腺、结肠、膀胱、肺肺泡和肾近端小管低水平表达。此外，正常上皮细胞上的FOLR1表达仅限于顶表面，与血液接触有限。在恶性转化的情况下，这种限制丧失，FOLR1在各种实体瘤（如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌）中过度表达，并与更侵袭性的肿瘤行为和对放化疗的不良反应相关。因此，FOLR1靶向疗法目前正在研究用于这些恶性肿瘤，许多研究集中在卵巢癌上。

FOLR1在治疗耐药骨肉瘤中的作用及其意义先前已有描述。尽管骨肉瘤表达的FOLR1的确切作用尚未很好阐明，但有证据表明FOLR1以比还原型叶酸载体（主导结合和运输甲氨蝶呤的受体，甲氨蝶呤是骨肉瘤治疗的主要药物）更低的浓度梯度摄取叶酸。此外，Yang及其同事从107例骨肉瘤患者样本中生成了患者来源异种移植（PDX）模型，其中84例（78.5%）具有可检测的FOLR1 mRNA表达，有些达到卵巢癌细胞系的FOLR1 mRNA表达水平。因此，该通路被认为是肿瘤细胞摄取叶酸的替代途径并允许肿瘤生长。我们最近发现FOLR1在由CBFA2T3::GLIS2融合驱动的高度难治性婴儿急性髓系白血病（AML）中表达。为了靶向这种难治性AML，我们使用farletuzumab的单链可变片段（scFv）、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ细胞毒性域开发了一种FOLR1特异性CAR-T细胞产品（FH FOLR1-CART）。FH FOLR1-CART在FOLR1阳性AML模型中表现出强大的抗白血病活性，且无造血毒性。该CART产品目前正在一项针对复发/难治性CBFA2T3-GLIS2 AML的1期临床试验（NCT06609928）中进行研究。为了将FH FOLR1-CART的使用扩展到其他难以治疗的恶性肿瘤，我们提供了FH FOLR1-CART对抗骨肉瘤的强有力的体外和体内证据。

Materials and Methods

Tumor mRNA expression profiling

从St. Jude Cloud获得了2,358例各种恶性肿瘤患者样本的全基因组测序数据。从Open Pediatric Cancer Project v15获得并下载了34,138例各种恶性肿瘤患者样本的RNA测序表达数据，并从儿科临床前测试联盟（现称为儿科临床前体内测试联盟（PIVOT））获得了244个样本。将标准化读数计数（每千碱基转录本每百万映射读数的片段数，FPKM）使用以下公式转换为每百万转录本数（TPM）：TPM = [FPKM / 总和（所有转录本的FPKM）] × 10⁶。所有转换均在R（v4.3.2）中进行。

Primary tumor cells

U-2 OS骨肉瘤细胞系由Stanley Lee博士慷慨赠送，并在DMEM（含10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）中培养。使用MycoAlert支原体检测试剂盒定期检测细胞是否存在支原体污染。使用CLA IdentiFiler Plus PCR扩增试剂盒在ABI 3730xl遗传分析仪上验证细胞系身份，并将等位基因调用与ATCC和Cellosaurus数据库中的细胞系条目进行比较。患者来源细胞系OS766、OS742、OS186、OS457和OS525由加利福尼亚大学旧金山分校的E. Alejandro Sweet-Cordero博士 kindly捐赠。患者来源细胞系通过短串联重复由Sweet-Cordero实验室确认。PDX肿瘤细胞系OS9和OS33由MD Anderson癌症中心的R. Gorlick博士慷慨捐赠，作为从PDX小鼠收集的实体瘤。这些细胞系在用胶原酶II解离成单细胞悬液后用于流式细胞术分析。所有其他患者来源细胞系在体外培养于含10% HyClone牛生长血清和1%青霉素/链霉素的DMEM中。

Lentiviral production and transduction of T cells

FOLR1-CAR T细胞的生成先前已有描述：通过用携带FOLR1 CAR载体（scFv源自farletuzumab，具有中等长度IgG4间隔区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ细胞毒性域）的慢病毒转导健康供体T细胞（来自Bloodworks Northwest）生成CAR T细胞。添加了由2A短肽序列分隔的截短CD19，并用作转导标记。使用抗人CD19微珠分选转导的细胞以表达CD19。分选的细胞在CTL（含50 U/mL IL-2）培养基中进一步扩增，然后进行体外和体内细胞毒性测定。通过FACS分析仪分析转导效率。

Flow cytometry

使用抗FOLR1-PE通过流式细胞术确认U-2 OS和患者来源细胞上的FOLR1表达。使用抗CD45-BUV805、抗CD3-BUV395、抗CD4-BV605、抗CD8-BV711和抗CD19-APC-eFluor780确认T细胞的免疫表型。使用抗小鼠CD45.1-APC以及所有先前列出的抗体确认体内组织样本的免疫表型。使用运行FACSDiva软件的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

In vitro cytotoxicity assay by flow cytometry

将2.5 × 10⁴个U-2 OS细胞与CD8⁺ T细胞以效应细胞与靶细胞（E:T）比率1:1、2:1、5:1和10:1在无IL-2的CTL培养基中共培养。共培养在37°C下孵育6小时和24小时后收获细胞。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit对细胞进行染色。使用运行FACSDiva软件的BD Canto II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

对于使用患者来源细胞系的体外细胞毒性测定，将2.5 × 10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与组合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1和10:1在无IL-2的CTL培养基中共培养。共培养在37°C下孵育24小时后收集细胞和上清液。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit对细胞进行染色。使用运行FACSDiva软件的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

Luminex

将T细胞（每孔1.0 × 10⁴个细胞，CD4与CD8 T细胞比例为1:1）与1.0 × 10⁴个U-2 OS细胞共培养24小时。对于使用患者来源细胞系的实验，将2.5 × 10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与组合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1共培养。在共培养24小时收集上清液，并使用Human Luminex Assay分析以量化IL-2、IFN-γ和TNFα。

IncuCyte

为了进一步评估长期细胞毒性，我们使用IncuCyte Live-Cell Analysis，使用表达e-GFP的U-2 OS细胞（1.0 × 10⁴个细胞）与CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1、2:1和5:1共培养。每30分钟采集一次图像，持续24小时。将IncuCyte Cytotox Red Reagent以1:2,000稀释度添加到培养基中以检测死细胞。

In vivo studies

从杰克逊实验室获得NOD/SCID/γc^?/?（NSG）小鼠，并在弗雷德·哈钦森癌症中心（FHCC）饲养和繁殖。将6至10周龄的年龄匹配的雌性小鼠随机分配到实验组。通过股骨内接种1 × 10⁶个细胞系来源的U-2 OS细胞（经编码eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导，由T2A核糖体跳过元件分隔以允许无创生物发光成像（IVIS））产生局部股骨肿瘤。通过尾静脉注射1 × 10⁶个经eGFP和萤火虫荧光素酶转导的U-2 OS细胞产生转移性肺病。在肿瘤细胞接种后13天通过IVIS确认肿瘤植入。在接种后14天通过尾静脉注射用5 × 10⁶个FOLR1-CAR或未转导（NT）T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

PDX骨肉瘤模型由R. Gorlick博士建立并共享。将从小鼠收集的冷冻皮下PDX骨肉瘤肿瘤解冻，并在6 mg/mL胶原酶II中解离约2小时。将解离的肿瘤细胞通过70 μm strainer，置于培养基中。用含有eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导肿瘤细胞。将细胞在培养中维持最多6周。通过尾静脉注射1 × 10⁶个解离并转导的PDX来源细胞在小鼠中产生转移性肺病。在肿瘤细胞接种后20天通过IVIS确认肿瘤植入。在接种后21天通过尾静脉注射用5 × 10⁶个FOLR1-CAR或NT T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

监测小鼠的疾病进展迹象，并每7至14天通过IVIS或LAGO X成像。当小鼠表现出症状性转移性疾病（呼吸急促、驼背、持续体重减轻或疲劳）时，对它们实施安乐死。在尸检时收获组织（血液、股骨、肺、肝、脾和肉眼可见的肿瘤）并分析是否存在骨肉瘤。

Peripheral T-cell collection and detection

通过眼眶后采血将外周血收集到薰衣草盖K2-EDTA管中，并使用红细胞裂解缓冲液（0.15 mol/L氯化铵、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.1 mol/L EDTA）去除红细胞。然后通过流式细胞术对细胞进行免疫表型分析。

MRI imaging

使用位于FHCC成像套房的临床前MR扫描仪评估肿瘤大小和进展。每只小鼠使用含有2%至2.5%异氟烷的麻醉诱导室进行麻醉。每只小鼠被放置在暖空气加热床上以防止麻醉期间体温过低。通过气动枕监测成像期间的呼吸。每次成像会话每只小鼠持续约10至30分钟。所有图像均使用小鼠体部射频线圈采集。使用的扫描技术是快速自旋回波T2加权扫描和快速自旋回波T1加权扫描。成像后，在空的热笼子中监测每只小鼠从麻醉中恢复的情况。

CT imaging

使用呼吸门控高速微型CT肺部3D数据集评估肿瘤大小和进展。在2%异氟烷麻醉诱导后，将每只小鼠放置在床上，并通过门控成像监测呼吸。数据集在90 kV管电压、88 μA管电流、36 mm视野、72 μm体素大小和每只小鼠总扫描时间4分钟下采集。钨阳极作为X射线源。在出口端口前放置一个0.5 mm铝和0.06 mm铜的固定过滤器，以去除对剂量有贡献但不改善图像质量的低能X射线。一次扫描给出的辐射剂量为912 mGy。使用呼吸门控输出的呼气数据集分析数据。成像后，每只小鼠在温暖的恢复笼中从麻醉中恢复。

Histopathology

由FHCC实验病理学共享资源进行苏木精和伊红（H&E）染色。收获肺组织，固定在10%中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片4至5 μm到带电载玻片上。将带有石蜡切片的载玻片在60°C下烘烤，使用自动染色机处理进行H&E染色，并用永久封片介质封片。由委员会认证的兽医病理学家检查载玻片。

Statistical analysis

使用未配对、双尾Student t检验确定所有使用U-2 OS和所有患者来源细胞系的体外研究的统计学显著性。使用对数秩（Mantel–Cox）检验比较实验组之间的Kaplan–Meier生存曲线。统计学显著性定义为P小于0.05。

Study approval

在获得FHCC机构动物护理和使用委员会（方案51068）批准后进行实验，并符合机构和国家级指南和法规。在获得FHCC机构审查委员会（方案9950）批准后进行该研究。该研究根据赫尔辛基宣言进行。

Results

FOLR1 mRNA expression in osteosarcoma

从公开可用的St. Jude儿科癌症基因组计划（PCGP）获得了原代患者病例的FOLR1 mRNA表达数据。PCGP包括跨越16种疾病类型的1,873个患者样本。虽然大多数其他肿瘤的样本显示很少或没有FOLR1表达（<2 FPKM），但大多数骨肉瘤肿瘤样本显示FOLR1表达，中位FOLR1 mRNA表达为5.614（n = 113；范围0–84.12）。发现表达FOLR1 mRNA的其他肿瘤类型包括室管膜瘤、脉络丛癌和AML。从PIVOT和Open Pediatric Cancer Project v15获得的额外数据重申了类似的发现。PIVOT数据库中共有244个样本可用，其中30个是骨肉瘤样本，表达中位TPM为10.448（范围0.056–50.976）。在Open Pediatric Cancer Project v15数据库中，31,172个患者样本中有102个来自骨肉瘤患者。这些样本的中位TPM为12.54（范围0.0–191.54）。正如先前所述，通过组织微阵列上的IHC测试了正常组织中的FOLR1表达，显示仅在甲状腺、肾小管上皮和肺上皮中有有限表达。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against the FOLR1-positive osteosarcoma cell line U-2 OS in vitro

使用标准骨肉瘤细胞系U-2 OS进行初步体外评估。U-2 OS通过流式细胞术显示高FOLR1细胞表面表达，平均荧光强度（MFI）为7,972，或比同种型对照增加58.2倍。先前测试的用作对照的AML细胞系包括WSU-AML（阳性对照）和Kasumi-1（阴性对照），它们分别显示比同种型对照的MFI增加5.96倍和1.5倍。验证了U-2 OS中的FOLR1表面表达后，我们通过将肿瘤细胞与CD8⁺ FH FOLR1-CART或NT T细胞以各种E:T比率（从10:1到1:1）共培养来评估FH FOLR1-CART的抗肿瘤活性。FH FOLR1-CART表现出强大的靶标特异性细胞毒性，范围从76.5%（E:T = 1:1）到97.4%（E:T = 10:1）（6小时）和95.5%（E:T = 1:1）到99%（E:T = 10:1）（24小时）。相反，与NT CD8⁺ T细胞共培养后的肿瘤细胞裂解百分比范围从23.8%（E:T = 1:1）到45.7%（E:T = 10:1）（6小时）和26.1%（E:T = 1:1）到44.8%（E:T = 10:1）（24小时）。在孵育0小时和20.5小时期间获得的活细胞成像显示，与FH FOLR1-CART共培养后肿瘤细胞死亡，表现为物体绿色区域减少和死细胞红色试剂摄取增加。相反，与NT T细胞共培养的U-2 OS肿瘤细胞孔显示持续肿瘤生长。通过测量在1:1共培养24小时收集的上清液中的促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα进一步证实了FH FOLR1-CART的激活，在与肿瘤细胞共培养的NT T细胞上清液中未检测到或检测到最小细胞因子。先前通过缺乏对FOLR1阴性Kasumi-1 AML细胞的细胞毒性证明了靶标特异性。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against a FOLR1-positive osteosarcoma cell line–derived xenograft model in vivo

我们接下来使用局部和转移性骨肉瘤细胞系来源异种移植（CDX）小鼠模型研究了FH FOLR1-CART的体内抗肿瘤活性。通过直接股骨内接种U-2 OS建立局部疾病，并通过IVIS成像确认肿瘤植入，两个治疗组之间肿瘤发射的平均辐射强度相当。接受NT T细胞的小鼠（n = 2）表现出进行性疾病，IVIS检测到的平均辐射强度增加，导致在第90天死亡。相反，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠（n = 2）显示植入的股骨疾病被根除，并且疾病控制维持到第190天，OS为100%。用FH FOLR1-CART治疗的小鼠通过一般外观和体重没有显示靶向/脱瘤不良反应的迹象/症状。通过肿瘤发射的平均辐射强度降低证明了治疗小鼠的肿瘤控制和肉眼疾病反应。除了IVIS，我们在T细胞输注后的多个时间点获得了局部疾病的MRI图像。用NT T细胞治疗的小鼠骨盆MRI显示肿瘤生长，涉及股骨周围的软组织肿块快速演变，以及受累股骨的骨破坏（接种后84天）。相反，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠的MRI图像在同一时间点显示没有肿瘤生长也没有骨破坏。

通过尾静脉注射肿瘤细胞建立体内转移性U-2 OS模型，导致肺转移性疾病。通过IVIS成像确认肿瘤植入并测量肿瘤发射的平均辐射强度。与局部疾病模型类似，NT对照组的小鼠（n = 3）出现进行性疾病，表现为测量的辐射强度增加，导致在肿瘤接种后190天100%死亡率。相反，接受FH FOLR1-CART的小鼠（n = 3）显示改善的OS至第190天。通过IVIS成像证明第26天的疾病控制，与同一时间点的对照组相比，平均辐射强度降低。在肿瘤接种后第133天获得的用NT T细胞治疗的小鼠的额外CT图像显示斑片状和结节状空气空间混浊，随着时间的推移而增长，变得毛刺状和融合， largely取代了正常肺实质。相反，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠显示正常表现的肺部，在任何时间点治疗后都没有空气空间混浊或肺部肿块，为肺转移性疾病的有效抗肿瘤活性提供了进一步证据。治疗组中的一只小鼠在失去FOLR1-CART持久性后，在第179天出现体重减轻需要安乐死。值得注意的是，在尸检时未发现肉眼可见的肿瘤。此外，对所有小鼠实施安乐死时收集的肺组织进行了骨肉瘤评估。所有三只用FH FOLR1-CART治疗的小鼠通过组织学检查在所有五个肺叶中均未显示疾病证据，而所有三只用NT T细胞治疗的小鼠被发现患有肺骨肉瘤。

在T细胞输注前一天以及输注后第5天、第12天和第55天收集小鼠的外周血样本。在局部和转移性疾病模型中，在第5天在外周血中检测到人T细胞，与接受NT T细胞的小鼠中可忽略的群体相比，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠中检测到的群体增加。在第12天注意到T细胞收缩，到第55天时两组中均未检测到人T细胞。

FH FOLR1-CART exhibits antitumor activity against patient-derived osteosarcoma in vitro and in vivo

为了开发更具临床相关性的模型系统，我们验证了FH FOLR1-CART在患者来源骨肉瘤模型中的疗效。七个骨肉瘤患者来源细胞系或组织中的五个通过流式细胞术显示高FOLR1表面表达，MFI范围从817到8,930，或比同种型对照增加4.3倍至159.5倍。七个患者来源模型中的两个，OS33和OS457，显示最小的FOLR1表达，MFI范围从70到238，或比同种型对照增加0.85倍至1.5倍。我们继续评估FH FOLR1-CART对四个FOLR1阳性（OS186、OS525、OS766和OS742）和一个FOLR1阴性（OS457）PDX细胞系的体外抗肿瘤活性。FH FOLR1-CART对所有四个FOLR1阳性患者来源细胞系在所有E:T比率下均表现出有效的细胞毒性，并且在FOLR1阴性患者来源细胞系中没有细胞毒性。通过与表达FOLR1的患者来源细胞系（OS186、OS525、OS766和OS742）共培养24小时后促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα分泌增加证实了FH FOLR1-CART的激活。同时，在肿瘤和NT T细胞的上清液以及FH FOLR1-CART与FOLR1阴性患者来源细胞系OS457共培养的上清液中未