FH FOLR1-CAR T细胞在骨肉瘤治疗中的抗肿瘤活性研究

本文推荐了一项针对复发/难治性骨肉瘤的创新性研究，重点探讨了靶向叶酸受体α（FOLR1）的嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的临床前有效性。研究通过多组学数据分析证实FOLR1在骨肉瘤中高表达，并在体外和体内（包括细胞源性异种移植CDX和患者源性异种移植PDX模型）系统中验证了FH FOLR1-CAR T细胞的特异性杀伤能力和完全清除肿瘤的效果。该研究为晚期骨肉瘤患者提供了新的治疗选择，并支持其向早期临床试验转化。

　　

摘要

转移性和复发性骨肉瘤的治疗仍然极具挑战性。尽管外科技术不断进步、化疗方案持续强化及靶向治疗不断发展，但患者预后仍不理想。过继性免疫疗法，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，虽处于发展初期，但对骨肉瘤等侵袭性实体瘤患者而言仍是一种有前景的治疗策略。叶酸受体α（FOLR1）在骨肉瘤的病理生理过程中具有重要功能，这使其成为潜在的 therapeutic 靶点。本研究团队近期将一种FOLR1特异性的CAR T细胞产品（FH FOLR1-CART）推进至婴儿急性髓系白血病（AML）的临床试验（NCT06609928），并进一步评估了该CAR构建体对骨肉瘤的疗效。研究提供了骨肉瘤患者样本、细胞系和患者来源异种移植（PDX）模型中FOLR1转录本和蛋白的全面表达谱，证实了其作为治疗靶点的重要性。此外，研究还在标准骨肉瘤细胞系和患者来源的异种移植模型中评估了FH FOLR1-CART的体外和体内疗效。

引言

骨肉瘤仍是一种难治性疾病，转移性患者的5年总生存（OS）率低于30%，而复发或难治性患者的生存率更低。过去三十年的临床试验未能通过强化化疗或添加靶向治疗改善患者结局。CAR T细胞等过继性细胞疗法用于实体瘤尚处于发展初期，但正在被积极研究。鉴于这些疗法的新颖性及存在“on-target, off-tumor”不良反应的风险，目前大多数研究聚焦于评估靶向GD2、B7-H3、叶酸受体、EGFR、HER2和GPC3等抗原的细胞产品的安全性。尽管这些产品的临床疗效尚不明确，但近期在成人滑膜肉瘤患者中使用MAGE-A4特异性T细胞受体T细胞疗法所取得的充分临床反应，促使了首款用于实体瘤的细胞疗法获得FDA批准，这一进展表明在合适靶点下，细胞疗法治疗实体瘤具有成功潜力。

FOLR1是一种位于细胞膜上的叶酸结合蛋白，正常在脉络丛、甲状腺、唾液腺、乳腺、结肠、膀胱、肺泡和肾近曲小管等组织中有低水平表达。此外，FOLR1在正常上皮细胞的表达限于顶膜表面，与血液接触有限。而在恶性转化过程中，这种限制性丧失，FOLR1在多种实体瘤（如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌）中过度表达，并与更具侵袭性的肿瘤行为和放化疗反应差相关。因此，针对FOLR1的靶向治疗目前正在这些恶性肿瘤中进行研究，许多研究聚焦于卵巢癌。

FOLR1在耐药骨肉瘤中的作用及其治疗意义先前已有描述。尽管FOLR1在骨肉瘤中的具体作用尚未完全阐明，但有证据表明，FOLR1以低于还原型叶酸载体（负责结合和运输甲氨蝶呤，后者是骨肉瘤治疗的主要药物）的浓度梯度摄取叶酸。此外，Yang及其同事从107例骨肉瘤患者样本中建立了患者来源异种移植（PDX）模型，其中84例（78.5%）检测到FOLR1 mRNA表达，部分表达水平达到卵巢癌细胞系的水平。因此，该通路被认为是肿瘤细胞摄取叶酸的替代途径，从而支持肿瘤生长。研究团队最近发现在由CBFA2T3::GLIS2融合基因驱动的高度难治性婴儿AML中也有FOLR1表达。为靶向这种难治性AML，团队开发了FOLR1特异性CAR T细胞产品（FH FOLR1-CART），其使用farletuzumab的单链可变片段（scFv）、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ胞毒结构域。FH FOLR1-CART在FOLR1阳性AML模型中表现出强大的抗白血病活性，且无造血毒性。该CAR T产品目前正在复发/难治性CBFA2T3-GLIS2 AML中进行1期临床试验（NCT06609928）。为了将FH FOLR1-CART拓展到其他难治性恶性肿瘤，本研究提供了其在骨肉瘤中具有强大体外和体内活性的证据。

材料与方法

肿瘤mRNA表达谱分析

从St. Jude Cloud获取了2,358例不同恶性肿瘤患者样本的全基因组测序数据。从Open Pediatric Cancer Project v15获取并下载了34,138例不同恶性肿瘤患者样本的RNA测序表达数据，并从儿科临床前测试联盟（现称为儿科临床前体内测试联盟，PIVOT）获取了244例样本。将标准化后的读段计数（FPKM）转换为TPM，所有转换在R（v4.3.2）中完成。

原代肿瘤细胞

U-2 OS骨肉瘤细胞系由Stanley Lee博士惠赠，使用DMEM（含10% FBS、1% L-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素）培养。使用MycoAlert Mycoplasma Detection Kit定期检测支原体污染。使用CLA IdentiFiler Plus PCR Amplification Kit在ABI 3730xl Genetic Analyzer上验证细胞系身份，并通过Thermo Fisher Connect Microsatellite Analysis软件分析结果，将等位基因呼叫与ATCC和Cellosaurus数据库中的条目进行比较。患者来源细胞系OS766、OS742、OS186、OS457和OS525由加利福尼亚大学旧金山分校的E. Alejandro Sweet-Cordero博士慷慨捐赠。患者特征详情见补充图S1。患者来源细胞系通过短串联重复序列由Sweet-Cordero实验室确认。PDX肿瘤细胞系OS9和OS33由MD Anderson癌症中心的R. Gorlick博士慷慨捐赠，这些是从PDX小鼠中收集的实体瘤。这些细胞系在用胶原酶II解离成单细胞悬液后，进行流式细胞术分析。所有其他患者来源细胞系在含10% HyClone Bovine Growth Serum和1%青霉素/链霉素的DMEM中体外培养。

慢病毒生产和T细胞转导

FOLR1-CAR T细胞的生成如前所述：通过用携带FOLR1 CAR载体（scFv源自farletuzumab，具有中等长度IgG4间隔区、CD28跨膜区、4-1BB共刺激域和CD3ζ胞毒结构域）的慢病毒转导健康供者T细胞（来自Bloodworks Northwest）生成CAR T细胞。添加了由2A短肽序列分隔的截短CD19，并用作转导标记。使用抗人CD19微珠分选转导细胞，分选后的细胞在CTL（含50 U/mL IL-2）培养基中进一步扩增，然后进行体外和体内细胞毒性测定。通过FACS分析仪分析转导效率（补充图S2）。

流式细胞术

使用抗FOLR1-PE确认U-2 OS和患者来源细胞上FOLR1的表达。使用抗CD45-BUV805、抗CD3-BUV395、抗CD4-BV605、抗CD8-BV711和抗CD19-APC-eFluor780确认T细胞的免疫表型。使用抗小鼠CD45.1-APC以及所有先前列出的抗体确认体内组织样本的免疫表型。使用运行FACSDiva软件的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

体外细胞毒性测定（流式细胞术）

将2.5×10⁴个U-2 OS细胞与CD8⁺ T细胞以1:1、2:1、5:1和10:1的效应细胞与靶细胞（E:T）比率在无IL-2的CTL培养基中共培养。共培养物在37°C下孵育6小时和24小时后收获细胞。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit对细胞进行染色。使用运行FACSDiva软件的BD Canto II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

对于使用患者来源细胞系的体外细胞毒性测定，将2.5×10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与混合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以1:1和10:1的E:T比率在无IL-2的CTL培养基中共培养。共培养物在37°C下孵育24小时后收集细胞和上清液。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit对细胞进行染色。使用运行FACSDiva软件的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo软件进行数据分析和可视化。

Luminex

将T细胞（每孔1.0×10⁴个细胞，CD4与CD8 T细胞比例为1:1）与1.0×10⁴个U-2 OS细胞共培养24小时。对于使用患者来源细胞系的实验，将2.5×10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与混合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以1:1的E:T比率共培养。在共培养24小时时收集上清液，并使用Human Luminex Assay定量IL-2、IFN-γ和TNFα。

IncuCyte

为了进一步评估长期细胞毒性，使用IncuCyte Live-Cell Analysis，将表达eGFP的U-2 OS细胞（1.0×10⁴个）与CD8⁺ T细胞以1:1、2:1和5:1的E:T比率共培养。每30分钟采集一次图像，持续24小时。将IncuCyte Cytotox Red Reagent以1:2000稀释度加入培养基中以检测死细胞。

体内研究

从The Jackson Laboratory获得NOD/SCID/γc^?/?（NSG）小鼠，并在Fred Hutchinson癌症中心（FHCC）饲养和繁殖。将6至10周龄的年龄匹配雌鼠随机分配到实验组。通过股骨内接种1×10⁶个经编码eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导的细胞系来源U-2 OS细胞建立局部股骨肿瘤，该载体通过T2A核糖体跳过元件分隔，允许进行非侵入性生物发光成像（IVIS）。通过尾静脉注射1×10⁶个经编码eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导的U-2 OS细胞建立转移性肺病。在肿瘤细胞接种后13天通过IVIS确认肿瘤植入。在接种后14天通过尾静脉注射给予5×10⁶个FOLR1-CAR或未转导（NT）T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

PDX骨肉瘤模型由R. Gorlick博士建立并分享。将冷冻保存的来自小鼠的皮下PDX骨肉瘤肿瘤解冻，并在6 mg/mL胶原酶II中解离约2小时。将解离的肿瘤细胞通过70 μm筛网，置于培养基中。用含有eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导肿瘤细胞。将细胞在培养中维持最多6周。通过尾静脉注射1×10⁶个解离并转导的PDX来源细胞建立小鼠转移性肺病。在肿瘤细胞接种后20天通过IVIS确认肿瘤植入。在接种后21天通过尾静脉注射给予5×10⁶个FOLR1-CAR或NT T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

监测小鼠的疾病进展迹象，并每7至14天通过IVIS或LAGO X成像一次。当小鼠表现出症状性转移性疾病（呼吸急促、驼背、持续体重减轻或疲劳）时实施安乐死。在尸检时收获组织（血液、股骨、肺、肝、脾和肉眼可见的肿瘤）并分析是否存在骨肉瘤。

外周T细胞收集和检测

通过眶后采血收集外周血到薰衣草盖K2-EDTA管中，并使用红细胞裂解缓冲液去除红细胞。然后通过流式细胞术对细胞进行免疫表型分析。

MRI成像

使用临床前MR扫描仪评估肿瘤大小和进展。每只小鼠使用含2%至2.5%异氟烷的麻醉诱导室进行麻醉。将每只小鼠放在温空气加热床上以防止麻醉期间体温过低。成像期间通过气动枕监测呼吸。每次成像会话每只小鼠持续约10至30分钟。所有图像使用小鼠体部射频线圈采集。使用的扫描技术是快速自旋回波T2加权扫描和快速自旋回波T1加权扫描。成像后，在空的热笼中监测每只小鼠从麻醉中恢复的情况。

CT成像

使用呼吸门控高速显微CT肺3D数据集评估肿瘤大小和进展。在2%异氟烷麻醉诱导后，将每只小鼠放在床上，并通过门控成像监测呼吸。以90 kV管电压、88 μA管电流、36 mm视野、72 μm体素大小和每只小鼠总扫描时间4分钟采集数据集。钨阳极作为X射线源。在出口端口前放置0.5 mm铝和0.06 mm铜的固定过滤器以去除有助于剂量但无助于改善图像质量的低能X射线。一次扫描给出的辐射剂量为912 mGy。使用呼吸门控输出的呼气数据集分析数据。成像后，每只小鼠在温暖的恢复笼中从麻醉中恢复。

组织病理学

由FHCC实验组织病理学共享资源进行苏木精和伊红（H&E）染色。收获肺组织，固定在10%中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片4至5 μm到带电载玻片上。将带有石蜡切片的载玻片在60°C下烘烤，使用自动染色机进行H&E染色，并用永久封片介质封片。由委员会认证的兽医病理学家检查载玻片。

统计分析

对于所有使用U-2 OS和所有患者来源细胞系的体外研究，使用非配对、双尾Student t检验确定统计学显著性。使用对数秩（Mantel–Cox）检验比较实验组之间的Kaplan–Meier生存曲线。定义统计学显著性为P小于0.05。

研究批准

实验经FHCC机构动物护理和使用委员会（协议51068）批准后进行，并符合机构和国家级指南和法规。研究经FHCC机构审查委员会（协议9950）批准后进行。研究按照赫尔辛基宣言进行。

结果

骨肉瘤中的FOLR1 mRNA表达

从公开可用的St. Jude儿科癌症基因组计划（PCGP）获取了原代患者病例的FOLR1 mRNA表达数据。PCGP包括跨越16种疾病类型的1,873个患者样本。虽然大多数其他肿瘤的样本显示很少或无FOLR1表达（<2 FPKM），但大多数骨肉瘤肿瘤样本显示FOLR1表达，中位FOLR1 mRNA表达为5.614（n=113；范围0–84.12）。其他发现表达FOLR1 mRNA的肿瘤类型包括室管膜瘤、脉络丛癌和AML。从PIVOT和Open Pediatric Cancer Project v15获取的额外数据重申了类似发现。PIVOT数据库中共有244个样本可用，其中30个是骨肉瘤样本，表达中位TPM为10.448（范围0.056–50.976）。在Open Pediatric Cancer Project v15数据库中，31,172个患者样本中有102个来自骨肉瘤患者。这些样本的中位TPM为12.54（范围0.0–191.54）。如前所述，通过组织微阵列免疫组化（IHC）测试了FOLR1在正常组织中的表达，显示仅在甲状腺、肾小管上皮和肺上皮中有有限表达。

FH FOLR1-CART对FOLR1阳性骨肉瘤细胞系U-2 OS表现出强大的体外抗肿瘤活性

使用标准骨肉瘤细胞系U-2 OS进行初步体外评估。U-2 OS通过流式细胞术显示高FOLR1细胞表面表达，平均荧光强度（MFI）为7,972，或比同型对照增加58.2倍。先前测试的用作对照的AML细胞系包括WSU-AML（阳性对照）和Kasumi-1（阴性对照），它们分别显示MFI比同型对照增加5.96倍和1.5倍。在验证了U-2 OS中FOLR1表面表达后，通过将肿瘤细胞与CD8⁺ FH FOLR1-CART或NT T细胞以10:1至1:1的各种E:T比率共培养来评估FH FOLR1-CART的抗肿瘤活性。FH FOLR1-CART表现出强大的靶向特异性细胞毒性，在6小时时范围从76.5%（E:T=1:1）到97.4%（E:T=10:1），在24小时时从95.5%（E:T=1:1）到99%（E:T=10:1）。相比之下，与NT CD8⁺ T细胞共培养后的肿瘤细胞裂解百分比在6小时时范围从23.8%（E:T=1:1）到45.7%（E:T=10:1），在24小时时从26.1%（E:T=1:1）到44.8%（E:T=10:1）。在孵育0小时和20.5小时时获得的活细胞成像显示，与FH FOLR1-CART共培养后肿瘤细胞死亡，表现为物体绿色区域减少和死细胞对红色试剂的摄取增加。相反，与NT T细胞共培养的U-2 OS肿瘤细胞孔显示持续肿瘤生长。通过测量在1:1共培养24小时时收集的上清液中检测到的促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα，进一步证实了FH FOLR1-CART的活化，而在与肿瘤细胞共培养的NT T细胞上清液中未检测到或仅检测到最低水平的细胞因子。先前已通过缺乏对FOLR1阴性Kasumi-1 AML细胞的细胞毒性证明了靶向特异性。

FH FOLR1-CART在FOLR1阳性骨肉瘤细胞系来源异种移植模型中表现出强大的体内抗肿瘤活性

接下来使用局部和转移性骨肉瘤细胞系来源异种移植（CDX）小鼠模型研究了FH FOLR1-CART的体内抗肿瘤活性。通过直接股骨内接种U-2 OS建立局部疾病，并通过IVIS成像确认肿瘤植入，两个治疗组之间肿瘤发出的平均辐射强度相当。接受NT T细胞的小鼠（n=2）表现出进行性疾病，IVIS显示平均辐射强度增加，导致在第90天死亡。相比之下，接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠（n=2）的植入股骨疾病被根除，并且疾病控制维持到第190天，OS为100%。接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠未表现出on-target/off-tumor不良反应的迹象/症状，通过一般外观和体重判断。通过肿瘤发出的平均辐射强度降低证明了治疗小鼠的肿瘤控制和肉眼疾病反应。除IVIS外，还在T细胞输注后的多个时间点获得了局部疾病的MRI图像。接受NT T细胞治疗的小鼠骨盆MRI显示肿瘤生长，受累股骨周围软组织肿块快速演变和骨破坏。相比之下，接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠MRI图像在同一时间点未显示肿瘤生长或骨破坏。

通过尾静脉注射肿瘤细胞建立体内转移性U-2 OS模型，导致肺转移性疾病。通过IVIS成像确认肿瘤植入，并测量肿瘤发出的平均辐射强度。与局部疾病模型类似，NT对照组小鼠（n=3）出现进行性疾病，表现为测量的辐射强度增加，导致在肿瘤接种后190天内100%死亡率。相比之下，接受FH FOLR1-CART的小鼠（n=3）表现出改善的OS至第190天。通过IVIS成像显示，在第26天时，与对照组相比，平均辐射强度降低，证明了疾病控制。在肿瘤接种后133天获得的接受NT T细胞治疗的小鼠的额外CT图像显示斑片状和结节状气腔混浊，随时间增长，变得毛刺状和融合， largely 取代正常肺实质。相比之下，接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠在任何时间点治疗后均显示正常表现的肺部，无气腔混浊或肺肿块，为肺转移性疾病的有效抗肿瘤活性提供了进一步证据。治疗组中的一只小鼠在第179天出现体重减轻需要安乐死，此时远超出CAR T细胞持久性丧失的时间点。值得注意的是，尸检未发现肉眼可见的肿瘤。此外，对所有小鼠实施安乐死时收集的肺组织进行了骨肉瘤评估。所有三只接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠通过组织学检查在所有五个肺叶中均未显示疾病证据，而所有三只接受NT T细胞治疗的小鼠均发现肺骨肉瘤。

在T细胞输注前一天以及输注后第5天、第12天和第55天收集小鼠的外周血样本。在局部和转移性疾病模型中，均在第5天检测到外周血中的人T细胞，与接受NT T细胞的小鼠中可忽略的群体相比，接受FH FOLR1-CART治疗的小鼠中检测到的群体增加。在第12天注意到T细胞收缩，到第55天时两组中均未检测到人T细胞。

FH FOLR1-CART对患者来源的骨肉瘤表现出体外和体内抗肿瘤活性

为了开发更具临床相关性的模型系统，我们在患者来源的骨肉瘤模型中验证了FH FOLR1-CART的疗效。七个骨肉瘤患者来源细胞系或组织中的五个通过流式细胞术显示高FOLR1表面表达，MFI范围从817到8,930，或比同型对照增加4.3倍至159.5倍。七个患者来源模型中的两个，OS33和OS457，显示最小的FOLR1表达，MFI范围从70到238，或比同型对照增加0.85倍至1.5倍。我们继续评估FH FOLR1-CART对四个FOLR1阳性（OS186、OS525、OS766和OS742）和一个FOLR1阴性（OS457）PDX细胞系的体外抗肿瘤活性。FH FOLR1-CART对所有四个FOLR1阳性患者来源细胞系在所有E:T比率下均表现出强大的细胞毒性，而在FOLR1阴性患者来源细胞系中无细胞毒性。通过与FOLR1表达的患者来源细胞系（OS186、OS525、OS766和OS742）共培养后促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα分泌增加，证实了FH FOLR1-CART的活化。同时，在肿瘤和NT T细胞的上清液中以及FH FOLR1-CART与FOLR1阴性患者来源细胞系OS457共培养的上清液中未检测到细胞因子。

我们进一步在体内PDX模型中验证了FH FOLR1-CART。通过尾静脉将OS9患者来源肿瘤细胞接种到