靶向FOLR1的CAR-T细胞疗法在晚期骨肉瘤中的临床前研究：从体外杀伤到体内完全缓解的突破性证据

本研究报告了一种靶向叶酸受体α（FOLR1）的CAR-T细胞疗法（FH FOLR1-CART），通过多组学数据证实FOLR1在骨肉瘤中广泛表达，并在细胞系衍生物（CDX）和患者衍生物（PDX）模型中证明其强大的抗肿瘤活性，为晚期骨肉瘤患者提供了新的治疗希望。

　　

Abstract

转移性和复发性骨肉瘤尽管有先进的手术技术、强化化疗和靶向治疗，仍然难以治疗。嵌合抗原受体（CAR）T细胞等过继免疫疗法处于起步阶段，但对于侵袭性实体瘤（如骨肉瘤）患者来说，仍然是一种可行的治疗策略。叶酸受体α（FOLR1）在骨肉瘤的病理生理学中具有功能性作用，这为其作为潜在治疗靶点提供了理论依据。研究团队最近将一种FOLR1特异性的CAR-T细胞产品（FH FOLR1-CART）推进了一项婴儿急性髓系白血病（AML）的试验（NCT06609928），并评估了该CAR构建体对骨肉瘤的效果。他们提供了骨肉瘤患者、细胞系和患者来源异种移植（PDX）模型中全面的FOLR1转录本和蛋白表达谱，证实了其作为治疗靶点的重要性。并进一步评估了FH FOLR1-CART在标准和患者来源的骨肉瘤细胞系及异种移植模型中的体外和体内疗效。

Introduction

骨肉瘤仍然是一种难以治疗的疾病，在转移性疾病的情况下，5年总生存率（OS）估计低于30%，对于复发或难治性疾病则更低。不幸的是，过去三十年中进行的先前试验未能证明通过强化化疗或添加靶向治疗可以改善结局。用于实体瘤的过继细胞疗法，如嵌合抗原受体（CAR）T细胞，正处于发展的初期阶段，但正在积极研究中。鉴于这些疗法的新颖性和靶向、脱瘤不良反应的风险，当前大多数研究侧重于描述针对诸如GD2、B7-H3、叶酸、EGFR、HER2和GPC3等抗原的细胞产品的安全性特征。尽管这些产品的临床疗效尚不清楚，但最近在成人滑膜肉瘤患者中使用MAGE-A4特异性T细胞受体T细胞显示出足够临床反应的进展，导致了首个用于实体瘤的细胞疗法获得FDA批准。这一进展证明了在适当靶向的情况下，细胞疗法治疗实体瘤的潜在成功。

叶酸受体α（FOLR1）是一种在细胞膜上表达的叶酸结合蛋白。它通常在脉络丛、甲状腺、唾液腺、乳腺、结肠、膀胱、肺肺泡和肾近端小管低水平表达。此外，正常上皮细胞上的FOLR1表达仅限于顶表面，与血液接触有限。这种限制在恶性转化的情况下丧失，因为FOLR1在多种实体瘤（如肺癌、乳腺癌、卵巢癌和胃癌）中过度表达，并与更侵袭性的肿瘤行为和放化疗反应差相关。因此，针对FOLR1的疗法目前正在对这些恶性肿瘤进行研究，许多研究侧重于卵巢癌。

FOLR1的作用及其在治疗耐药骨肉瘤中的意义先前已被描述。尽管骨肉瘤表达的FOLR1的确切作用尚未很好阐明，但有证据表明FOLR1以比还原叶酸载体更低的浓度梯度摄取叶酸，还原叶酸载体是结合和运输甲氨蝶呤（骨肉瘤治疗的主要药物）的主要受体。此外，Yang及其同事从107个骨肉瘤患者样本中生成了患者来源异种移植（PDX）模型，其中84个（78.5%）具有可检测的FOLR1 mRNA表达，有些达到卵巢癌细胞系的FOLR1 mRNA表达水平。因此，该通路被 implicated 作为肿瘤细胞摄取叶酸的替代途径并允许肿瘤生长。研究团队最近发现FOLR1在由CBFA2T3::GLIS2融合驱动的高度难治性婴儿急性髓系白血病（AML）中表达。为了靶向这种难治性AML，他们使用farletuzumab的单链可变片段（scFv）、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞毒性结构域开发了一种FOLR1特异性的CAR-T细胞产品（FH FOLR1-CART）。FH FOLR1-CART在FOLR1阳性AML模型中表现出强大的抗白血病活性，且无造血毒性。该CART产品目前正在一项针对复发/难治性CBFA2T3-GLIS2 AML的1期临床试验（NCT06609928）中进行研究。为了扩大FH FOLR1-CART用于其他难治恶性肿瘤的目标，他们提供了FH FOLR1-CART对抗骨肉瘤的强大体外和体内证据。

Materials and Methods

Tumor mRNA expression profiling

从St. Jude Cloud获得了2,358个各种恶性肿瘤患者样本的全基因组测序数据。从Open Pediatric Cancer Project v15获得并下载了34,138个各种恶性肿瘤患者样本的RNA测序表达数据，并从儿科临床前测试联盟（现称为儿科临床前体内测试联盟，PIVOT）获得了244个样本。将标准化读数计数（每千碱基转录本每百万映射读数的片段数，FPKM）使用以下公式转换为每百万转录本数（TPM）：TPM = [FPKM / 总和（所有转录本的FPKM）] × 10⁶。所有转换均在R（v4.3.2）中进行。

Primary tumor cells

U-2 OS骨肉瘤细胞系由Dr. Stanley Lee慷慨赠送，并在DMEM（Gibco, cat. # 11965-092）中加入10% FBS、1% L-谷氨酰胺（Gibco, 25030-081）和1%青霉素/链霉素（Gibco, 15140-122）中培养。使用MycoAlert Mycoplasma Detection Kit [Lonza Corporation]常规测试支原体污染。使用CLA IdentiFiler Plus PCR Amplification Kit [Thermo Fisher Scientific]在ABI 3730xl Genetic Analyzer [Thermo Fisher Scientific]上验证细胞系身份。使用Thermo Fisher Connect Microsatellite Analysis software分析结果，并将等位基因调用与ATCC和Cellosaurus数据库中的细胞系条目进行比较。患者来源的细胞系OS766、OS742、OS186、OS457和OS525由加州大学旧金山分校的Dr. E. Alejandro Sweet-Cordero kindly捐赠。患者特征详情见Supplementary Fig. S1。患者来源的细胞系由Sweet-Cordero Laboratory通过短串联重复（STR）确认。PDX肿瘤细胞系OS9和OS33由MD Anderson Cancer Center的Dr. R. Gorlick慷慨捐赠，作为从PDX小鼠收集的实体瘤。这些细胞系在用胶原酶II（Gibco, #17101015）解离成单细胞悬液后进行流式细胞术分析。所有其他患者来源的细胞系在体外使用DMEM加10% HyClone Bovine Growth Serum [Cytiva] #SH30541和1%青霉素/链霉素培养。

Lentiviral production and transduction of T cells

FOLR1-CAR T细胞的生成先前已有描述：通过用携带FOLR1 CAR载体（scFv源自farletuzumab，具有中等长度的IgG4间隔区、CD28跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞毒性结构域）的慢病毒转导健康供体T细胞（Bloodworks Northwest）来生成CAR T细胞。添加了由2A短肽序列分隔的截短CD19，并用作转导标记。使用抗人CD19微珠[Miltenyi Biotec, 130-050-301]分选转导的细胞以获取CD19表达。分选的细胞在CTL（含50 U/mL IL-2）培养基中进一步扩增，然后进行体外和体内细胞毒性测定。通过FACS分析仪分析转导效率（Supplementary Fig. S2）。

Flow cytometry

使用抗FOLR1-PE [BioLegend 908304]确认U-2 OS和患者来源细胞上的FOLR1表达。使用抗CD45-BUV805 [BD Biosciences 612891]、抗CD3-BUV395 [BD Biosciences 564001]、抗CD4-BV605 [BD Biosciences 562658]、抗CD8-BV711 [BD Biosciences 563677]和抗CD19-APC-eFluor780 [eBioscience 47-0198-42]确认T细胞的免疫表型。使用抗小鼠CD45.1-APC [BD Biosciences 558701]以及所有先前列出的抗体确认体内组织样本的免疫表型。使用运行FACSDiva software [BD Biosciences]的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo software进行数据分析和可视化。

In vitro cytotoxicity assay by flow cytometry

将2.5 × 10⁴个U-2 OS细胞与CD8⁺ T细胞以效应细胞与靶细胞（E:T）比率1:1、2:1、5:1和10:1在不含IL-2的CTL培养基中共培养。共培养在37°C下孵育6小时和24小时后收获细胞。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit [Invitrogen L34955]对细胞进行染色。使用运行FACSDiva software [BD Biosciences]的BD Canto II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo software进行数据分析和可视化。

对于使用患者来源细胞系的体外细胞毒性测定，将2.5 × 10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与组合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1和10:1在不含IL-2的CTL培养基中共培养。共培养在37°C下孵育24小时后收集细胞和上清液。使用Fixable Violet Dead Cell Stain Kit [Invitrogen L34955]对细胞进行染色。使用运行FACSDiva software [BD Biosciences]的BD Symphony II流式细胞仪进行分析。使用FlowJo software进行数据分析和可视化。

Luminex

将T细胞（每孔1.0 × 10⁴个细胞，CD4与CD8 T细胞比例为1:1）与1.0 × 10⁴个U-2 OS细胞共培养24小时。对于使用患者来源细胞系的实验，将2.5 × 10⁴个细胞（OS186、OS525、OS742、OS766和OS457）与组合的CD4⁺和CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1共培养。在共培养24小时收集上清液，并使用Human Luminex Assay分析以量化IL-2 [捕获抗体由BD Biosciences #555051；检测抗体由BD Biosciences #555040]、IFN-γ [捕获抗体由Invitrogen #M700A；检测抗体由Invitrogen #M701B]和TNFα [捕获抗体由BD Biosciences #551220；检测抗体由BD Biosciences #554511]。

IncuCyte

为了进一步评估长期细胞毒性，使用IncuCyte Live-Cell Analysis [Sartorius]使用表达e-GFP的U-2 OS细胞（1.0 × 10⁴个细胞）与CD8⁺ T细胞以E:T比率1:1、2:1和5:1共培养。每30分钟获取图像，持续24小时。将IncuCyte Cytotox Red Reagent (Essen Bioscience, 4632)以1:2,000稀释度添加到培养基中以检测死细胞。

In vivo studies

从The Jackson Laboratory获得NOD/SCID/γc^?/? (NSG)小鼠，并在Fred Hutchinson Cancer Center (FHCC)饲养和繁殖。将6至10周龄的年龄匹配的雌性随机分配到实验组。通过股骨内接种1 × 10⁶个细胞系衍生的U-2 OS细胞（经编码eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导，由T2A核糖体跳过元件分隔以允许无创生物发光成像（IVIS））产生局部股骨肿瘤。通过尾静脉注射1 × 10⁶个经eGFP和萤火虫荧光素酶转导的U-2 OS细胞产生转移性肺病。在肿瘤细胞接种后13天通过IVIS确认肿瘤植入。在接种后14天通过尾静脉注射用5 × 10⁶个FOLR1-CAR或非转导（NT）T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

PDX骨肉瘤模型由Dr. R. Gorlick建立和共享。将从小鼠收集的冷冻皮下PDX骨肉瘤肿瘤解冻，并在6 mg/mL胶原酶II（Gibco, 17101-015）中解离约2小时。将解离的肿瘤细胞通过70-μm strainer，放入培养基[DMEM (Gibco, 11965-092) + 10% FBS (Corning, 35-010-CV) + 1% penicillin–streptomycin (Gibco, 15140122) + 2 mmol/L L-glutamine (Gibco, 25030081)]中。用含有eGFP和萤火虫荧光素酶的载体转导肿瘤细胞。将细胞在培养中维持最多6周。通过尾静脉注射1 × 10⁶个解离和转导的PDX衍生细胞在小鼠中产生转移性肺病。在肿瘤细胞接种后20天通过IVIS (Spectral Instruments Imaging LAGO X)确认肿瘤植入。在接种后21天通过尾静脉注射用5 × 10⁶个FOLR1-CAR或NT T细胞（CD4⁺与CD8⁺ T细胞比例为1:1）治疗小鼠。

监测小鼠的疾病进展迹象，并每7至14天通过IVIS或LAGO X成像。当小鼠表现出症状性转移性疾病（呼吸急促、驼背、持续体重减轻或疲劳）时，对其进行安乐死。在尸检时收获组织（血液、股骨、肺、肝、脾和肉眼可见肿瘤）并分析是否存在骨肉瘤。

Peripheral T-cell collection and detection

通过眶后采血将外周血收集到薰衣草帽K2-EDTA管中，并使用红细胞裂解缓冲液（0.15 mol/L氯化铵、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.1 mol/L EDTA）去除红细胞。然后如上所述通过流式细胞术对细胞进行免疫表型分析。

MRI imaging

使用位于FHCC成像套件的临床前MR扫描仪（MR Solutions, DRYMAG7.0T）评估肿瘤大小和进展。每只小鼠使用含有2%至2.5%异氟烷分布的精密蒸发器通过麻醉诱导室进行麻醉。将每只小鼠放在温暖的空气加热床上以防止麻醉期间体温过低。通过气动枕（SA Instruments, ERT gating module）监测成像期间的呼吸。每次成像会话每只小鼠持续约10至30分钟。使用小鼠身体射频线圈获取所有图像。使用的扫描技术是快速自旋回波T2加权扫描和快速自旋回波T1加权扫描。成像后，在空的温暖笼子中监测每只小鼠从麻醉中恢复的情况。

CT imaging

使用呼吸门控高速显微CT肺3D数据集（Quantum GX2显微CT, Perkin Elmer）评估肿瘤大小和进展。在用2%异氟烷麻醉诱导后，将每只小鼠放在床上，并通过门控成像监测呼吸。以90 kV管电压、88 μA管电流、36 mm视野、72 μm体素大小和每只小鼠总扫描时间4分钟获取数据集。钨阳极用作X射线源。在出口端口前放置0.5 mm铝和0.06 mm铜的固定过滤器以去除贡献剂量但不改善图像质量的低能X射线。一次扫描给出912 mGy的辐射剂量。使用呼吸门控输出的呼气数据集分析数据。成像后，每只小鼠在温暖的恢复笼中从麻醉中恢复。

Histopathology

由FHCC Experimental Histopathology共享资源（P30 CA015704）进行苏木精和伊红（H&E）染色。收获肺组织，固定在10%中性缓冲福尔马林中，包埋在石蜡中，并在4至5 μm切片到带电载玻片上。将带有石蜡切片的载玻片在60°C下烘烤，使用自动染色机[Sakura Tissue-Tek Prisma]进行H&E染色，并用永久封片介质封片。由董事会认证的兽医病理学家（R. Gorlick）检查载玻片。

Statistical analysis

使用未配对、双尾Student t检验确定所有使用U-2 OS和所有患者来源细胞系的体外研究的统计学显著性。使用对数秩（Mantel–Cox）检验比较实验组之间的Kaplan–Meier生存曲线。统计学显著性定义为P小于0.05。

Study approval

在获得FHCC机构动物护理和使用委员会（协议51068）批准后进行实验，并符合机构和国家级指南和法规。在获得FHCC机构审查委员会（协议9950）批准后进行该研究。该研究根据赫尔辛基宣言进行。

Results

FOLR1 mRNA expression in osteosarcoma

从公开可用的St. Jude’s Pediatric Cancer Genome Project (PCGP)获得原发性患者病例的FOLR1 mRNA表达数据。PCGP包括跨越16种疾病类型的1,873个患者样本。虽然大多数其他肿瘤的样本显示很少或没有FOLR1表达（<2 FPKM），但大多数骨肉瘤肿瘤样本显示FOLR1表达，中位FOLR1 mRNA表达为5.614（n = 113；范围，0–84.12）。发现表达FOLR1 mRNA的其他肿瘤类型包括室管膜瘤、脉络丛癌和AML（图1A）。从PIVOT（先前称为儿科临床前测试联盟）和Open Pediatric Cancer Project v15获得的额外数据重申了类似发现。PIVOT数据库中共有244个样本可用，其中30个是骨肉瘤样本，表达中位TPM为10.448（范围，0.056–50.976；图1B）。在Open Pediatric Cancer Project v15数据库中，31,172个患者样本中有102个来自骨肉瘤患者。这些样本的中位TPM为12.54（范围，0.0–191.54；图1C）。如前所述，通过组织微阵列上的IHC测试了正常组织中的FOLR1表达，显示仅在甲状腺、肾小管上皮和肺上皮中有有限表达（Supplementary Fig. S3）。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against the FOLR1-positive osteosarcoma cell line U-2 OS in vitro

使用标准骨肉瘤细胞系U-2 OS进行初步体外评估。U-2 OS通过流式细胞术显示高FOLR1细胞表面表达，平均荧光强度（MFI）为7,972或比同种型对照增加58.2倍（图2A）。先前测试的AML细胞系用作对照，包括WSU-AML（阳性对照）和Kasumi-1（阴性对照），它们显示MFI比同种型对照分别增加5.96倍和1.5倍。在验证U-2 OS中的FOLR1表面表达后，通过将肿瘤细胞与CD8⁺ FH FOLR1-CART或NT T细胞以各种E:T比率（从10:1到1:1）共培养来评估FH FOLR1-CART的抗肿瘤活性。FH FOLR1-CART表现出强大的靶向特异性细胞毒性，在6小时时范围从76.5%（E:T = 1:1）到97.4%（E:T = 10:1），在24小时时从95.5%（E:T = 1:1）到99%（E:T = 10:1）。相反，与NT CD8⁺ T细胞共培养后的肿瘤细胞裂解百分比在6小时时范围从23.8%（E:T = 1:1）到45.7%（E:T = 10:1），在24小时时从26.1%（E:T = 1:1）到44.8%（E:T = 10:1）（图2B）。在孵育期间0小时和20.5小时获得的活细胞成像显示，与FH FOLR1-CART共培养后肿瘤细胞死亡，表现为物体绿色面积减少和死细胞对红色试剂的摄取增加。相反，与NT T细胞共培养的U-2 OS肿瘤细胞孔显示持续肿瘤生长（图2C）。通过测量在1:1共培养24小时收集的上清液中检测到的促炎细胞因子IL-2、IFN-γ和TNFα进一步证实FH FOLR1-CART活化，在NT T细胞与肿瘤细胞共培养的上清液中未检测到或仅检测到最小细胞因子（图2D）。先前通过缺乏对FOLR1阴性Kasumi-1 AML细胞的细胞毒性证明了靶向特异性（Supplementary Fig. S4）。

FH FOLR1-CART demonstrates robust antitumor activity against a FOLR1-positive osteosarcoma cell line–derived xenograft model in vivo

接下来使用局部和转移性骨肉瘤细胞系衍生异种移植（CDX）小鼠模型研究FH FOLR1-CART的体内抗肿瘤活性。通过直接股骨内接种U-2 OS建立局部疾病，并通过IVIS成像确认肿瘤植入，两个治疗组之间肿瘤发射的平均辐射强度相当（图3A）。接受NT T细胞的小鼠（n = 2）表现出进行性疾病，IVIS检测到的平均辐射强度发射增加，导致在第90天死亡。相反，在用FH FOLR1-CART治疗的小鼠（n = 2）中，植入的股骨疾病被根除，并且疾病控制得以维持，在第190天时OS为100%（P = 0.0896；图3B）。用FH FOLR1-CART治疗的小鼠未表现出靶向/脱瘤不良反应的迹象/症状，通过一般外观和体重判断。通过肿瘤发射的平均辐射强度降低证明了治疗小鼠的肿瘤控制和肉眼疾病反应（图3C）。除了IVIS，还在T细胞输注后的多个时间点获得了局部疾病的MRI图像。用NT T细胞治疗的小鼠骨盆MRI显示肿瘤生长，受累股骨周围软组织肿块快速演变和骨破坏，在肿瘤细胞接种后84天（图3D和E）。相反，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠的MRI图像在同一时间点未显示肿瘤生长或骨破坏（图3F）。

通过尾静脉注射肿瘤细胞建立体内转移性U-2 OS模型，导致肺转移性疾病。通过IVIS成像确认肿瘤植入，并测量肿瘤发射的平均辐射强度（图4A）。与局部疾病模型类似，NT对照组中的小鼠（n = 3）出现进行性疾病，表现为测量的辐射强度增加，导致在肿瘤接种后190天内100%死亡率。相反，接受FH FOLR1-CART的小鼠（n = 3）表现出改善的OS至第190天（P = 0.1098；图4B）。通过IVIS成像证明在第26天疾病控制，与同一时间点的对照组相比，平均辐射强度降低（图4C）。在肿瘤细胞接种后133天获得的用NT T细胞治疗的小鼠的额外CT图像显示斑片状和结节状气腔混浊，随时间增长，变得针状和融合，很大程度上取代了正常肺实质（图4D）。相反，用FH FOLR1-CART治疗的小鼠显示正常表现的肺，在任何时间点治疗后都没有气腔混浊或肺肿块（图4E），为有效的肺转移性疾病抗肿瘤活性提供了进一步证据。治疗组中的一只小鼠在179天出现体重减轻需要安乐死，远在FOLR1-CART持久性丧失之后。值得注意的是，在尸检时未发现肉眼可见肿瘤。此外，对所有小鼠安乐死时收集的肺组织进行了骨肉瘤评估。所有三只用FH FOLR1-CART治疗的小鼠通过组织学在所有五个肺叶中均未显示疾病证据（图4F），而所有三只用NT T细胞治疗的小鼠被发现患有肺骨肉瘤（图4G）。

在输注前一天以及输