靶向HER2构象暴露表位的肿瘤特异性单抗mAb104的特征及其治疗潜力

本刊推荐：本文首次报道了靶向HER2（人表皮生长因子受体2）构象暴露表位的新型单克隆抗体mAb104。该抗体特异性结合HER2结构域II，在肿瘤微环境中因HER2扩增或激活而暴露，但在正常组织中不可及。研究证实mAb104具有显著的体内抗肿瘤活性（与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗相当），出色的肿瘤靶向性（通过89Zr标记示踪及PET/MRI成像验证）以及内化能力，为开发新型HER2靶向疗法（包括裸抗体、抗体药物偶联物ADC及放射性核素疗法）提供了重要依据。

　　

Abstract

研究团队成功开发了一种新型抗HER2单克隆抗体mAb104，该抗体靶向HER2受体结构域II中的一个构象暴露表位。该表位在肿瘤组织中因HER2基因扩增或受体激活而暴露，但在正常组织中由于构象限制无法被抗体结合。与既往针对构象暴露表位抗体的研究一致，mAb104在体外实验中未显示活性，但在体内表现出强大的抗肿瘤效果，其抗肿瘤活性在程度上与曲妥珠单抗（Trastuzumab）和帕妥珠单抗（Pertuzumab）相当，并且与曲妥珠单抗联用时效果优于曲妥珠单抗单药。通过免疫组织化学（IHC）对正常组织和肿瘤组织进行筛选，证实mAb104不与正常组织结合，凸显了其肿瘤特异性。体内生物分布和成像数据证明了mAb104在HER2阳性肿瘤中的特异性靶向。共聚焦显微镜清晰地展示了mAb104被肿瘤细胞内化的过程，这与mAb104-HER2复合物的胞内运输轨迹一致。mAb104具有肿瘤特异性，在HER2阳性模型中展现强效抗肿瘤活性，并能内化进入HER2阳性肿瘤细胞。这些结果表明mAb104作为一种新型HER2靶向疗法具有巨大潜力，既可作为裸抗体用于信号阻断治疗，也可作为抗体-药物偶联物（ADC）或用于β/α粒子治疗的载体进行 payload 递送。

Introduction

过去十年中，癌症治疗的许多进展来自于能够特异性靶向癌症相关蛋白的更选择性药物。其中一类药物靶向ErbB家族。ErbB蛋白激酶家族包括四个细胞表面受体：EGFR（亦称ErbB1或HER1）、ErbB2（亦称HER2或Neu）、ErbB3（或HER3）和ErbB4（或HER4）。尽管缺乏特定的内源性配体，HER2的天然构象有利于ErbB家族单体之间的同源或异源二聚化相互作用，以及预先存在的非活性二聚体的寡聚化，从而导致细胞内激酶结构域的自身磷酸化和信号转导。HER2过表达在许多上皮肿瘤中被观察到，通常与恶性转化、肿瘤生长、抗凋亡特性的发展、侵袭性增加和耐药性相关。许多靶向HER2的疗法已在临床中进行测试，其中最主要的例子是曲妥珠单抗。曲妥珠单抗结合HER2胞外结构域（ECD）IV，是HER2阳性乳腺癌治疗的基石，也是唯一在晚期胃癌中显示生存获益的获批生物疗法。另一种HER2抗体帕妥珠单抗，是HER二聚化抑制剂类的首个药物；它结合HER2胞外二聚化结构域II，并抑制其与其他HER受体的二聚化。尽管已有其他靶向HER2 ECD的抗被描述，但尚未有成功进入常规临床使用。

研究团队此前开发了一类新型抗体，其靶向在肿瘤特异性条件下（如EGFR过表达、突变或配体激活形式）EGFR上构象暴露的表位。其中最先进的是mAb806。其人源化形式ABT-806（即Depatuxizumab Mafodotin，ABT-414）已被证明具有肿瘤特异性、良好的耐受性，且无常规抗EGFR毒性。基于mAb806的肿瘤特异性靶向，开发了抗体药物偶联物（ADC）Depatuxizumab Mafodotin（ABT-414，艾伯维），由mAb806与细胞毒性payload 单甲基澳瑞他汀F（Monomethyl Auristatin F）连接而成。在I期研究确认其安全性后，Depatuxizumab Mafodotin在一项大型III期试验（INTELLANCE I；NCT02573324）中用于新诊断胶质母细胞瘤（GBM）患者评估，并在II期INTELLANCE 2/EORTC试验（NCT02343406）中用于复发GBM患者评估。此外，基于mAb806的下一代ADC版本正在早期临床试验中进行评估（NCT02365662, NCT03234712, 和 NCT04721015）。

研究团队现又生成了新型首创（first-in-class）抗HER2单克隆抗体，其靶向HER2中的一个构象暴露表位。这些新型抗体的结合需要受体激活时发生的构象变化，其中HER2受体结构域II的二硫键可以动态地形成和断裂。该表位的暴露发生在肿瘤特异性条件下；例如，HER2的过表达导致该表位的非生理性暴露。本文描述了先导候选物mAb104的特征和治疗潜力。此外，还进行了相关的药效学研究以探索治疗效果，并利用锆-89（⁸⁹Zr）标记的mAb104进行了生物分布研究，以确定mAb104的肿瘤特异性、正常组织分布和成像特性。

Materials and Methods

杂交瘤克隆生成与抗体生产

通过用来自HER2 ECD的肽免疫原（COOH-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH2 (SEQ ID NO: 1)，通过半胱氨酸残基折叠成环并与钥孔血蓝蛋白（KLH）连接）免疫小鼠，产生了分泌靶向HER2 ECD构象暴露区域新型单克隆抗体的杂交瘤克隆。该序列获自NCBI数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_004439.2）。该区域位于结构域II内，但远离已知的帕妥珠单抗表位。

细胞系

所用人类癌细胞系包括BT-474、HCC1954、MCF-7、SK-BR-3、NCI-N87、NCI-H2170、NCI-H1650、NCI-H522和NCI-H838，购自ATCC和Asterand Bioscience。胃细胞系OE-19购自CellBank Australia。乳腺癌细胞系（BT-474, HCC1954, MCF-7, SK-BR-3）源自女性患者。胃癌细胞系（NCI-N87, OE-19）和肺癌细胞系（NCI-H2170, NCI-H1650, NCI-H522, NCI-H838）均源自男性患者。细胞库在到达后立即制备，并由Olivia Newton-John癌症研究所中心细胞库储存。2020年对NCI-N87、BT-474和HCC1954细胞，以及2023年对MCF-7细胞通过短串联重复（STR）谱分析进行了进一步的细胞系认证。细胞在从液氮储存复苏后传代3次内使用，所有实验均在35代以内进行。使用MycoAlert支原体检测试剂盒（Lonza Bioscience）常规确认细胞为支原体阴性。所有细胞系在37°C、5% CO₂条件下，使用添加了10%胎牛血清（FBS，Bovogen）、1%青霉素/链霉素和2 mmol/L谷氨酰胺（Life Technologies）的RPMI或DMEM/F12（Life Technologies）培养基培养。患者来源的肿瘤样本来自当地合作者（Elgene Lim博士）。这些样本在术中获取，并通过IHC和FISH分别筛选激素受体状态和HER2过表达及扩增。供体样本未经治疗，因此假定100%的肿瘤对所有抗HER2疗法敏感。生成的患者来源异种移植（PDX）模型14.06A.G3用于体内研究，该研究经Austin Health人类研究伦理委员会批准。

抗体与试剂

重组HER2 ECD由学术合作者A.W. Burgess教授（Walter and Eliza Hall医学研究所）提供。IgG1同种型抗体LMH3（由Ludwig癌症研究所提供）用作同种型对照抗体。曲妥珠单抗和帕妥珠单抗（Genentech）为购买所得。

ELISA

进行ELISA以确认四个候选克隆（命名为mAb104、mAb105、mAb106和mAb107）对HER2-ECD的结合特异性。简要而言，聚苯乙烯96孔板预先用PBS中的3% FCS包被，然后加入3 μg/mL与KLH偶联的线性或环状HER2肽免疫原、阴性对照偶联肽-KLH或重组HER2-ECD于稀释缓冲液中孵育1小时，随后加入10 μg/mL抗体。与抗小鼠IgG-碱性磷酸酶（1:3,000稀释，Sigma-Aldrich, A3688）抗体孵育1小时后，使用对硝基苯磷酸盐底物测量磷酸酶活性。所有孵育均在室温下进行。

为评估mAb104对HER2-ECD的特异性，将聚苯乙烯96孔板用3 μg/mL重组HER2-ECD、HER3-ECD、HER4-ECD或EGFR-501在4°C下包被过夜，用PBS中的3% FCS封闭，随后加入10 μg/mL系列稀释的纯化抗体及适当对照，室温孵育1小时，然后加入抗小鼠IgG-碱性磷酸酶，使用对硝基苯磷酸盐底物测量磷酸酶活性。使用SPECTROstar微孔板读板机（BMG Labtech）在405 nm波长下测量吸光度。

流式细胞术（FACS）分析

将铺在96孔板中的细胞与10 μg/mL抗HER2抗体或IgG1同种型对照抗体在4°C下孵育1小时。人源化抗体曲妥珠单抗和帕妥珠单抗使用Alexa Fluor 488标记的抗人IgG抗体（Thermo Fisher Scientific）检测。结合的小鼠抗体使用Alexa Fluor 488标记的抗小鼠IgG抗体检测。

生物传感器分析

表面等离子体共振（SPR）动力学分析在Biacore T200系统中进行，使用羧甲基葡聚糖包被的传感器芯片（CM5-S，GE Life Sciences）。将mAb104、帕妥珠单抗或曲妥珠单抗样品稀释至320至0 μg/mL浓度（以2倍稀释，即2,133–0 nmol/L）。样品以45 μL/分钟的流速注射200秒（30 μL，10 μL/分钟）流过固定的HER2-ECD。注射阶段后，通过流动运行缓冲液监测解离600秒。结合的抗体通过注射30 μL 50 mmol/L NaOH（30 μL/分钟，30秒）进行洗脱，并在样品之间再生芯片表面。

Western Blot分析

癌细胞系裂解物在4%至12% SDS-PAGE上分离，并免疫印迹检测mAb104和HER2。GAPDH用作上样对照以进行蛋白标准化。细胞用100 μg/mL抗体处理24小时，之后一半孔用100 ng EGF在室温下处理10分钟。使用商业抗体（购自Cell Signaling Technology）针对HER2 (#2242)、HER2 pTyr1221/1222 (#2243)、AKT (#4691)、AKT pSer473 (#4060)、ERK (#4695)、ERK pThr202/Tyr204 (#4370)、p70-S6激酶 (#2211)和pS6 (Ser 235/236; #2947)评估总蛋白和MAPK活化情况。抗GAPDH (AbC-1001)抗体购自AbClon。使用AbSignal (AbClon, AbC-3001)显色。

正常组织和肿瘤细胞与组织的免疫组织化学（IHC）

为确认mAb104的肿瘤选择性，我们通过IHC评估了一系列正常和肿瘤组织对mAb104的反应性。将mAb104的染色模式与使用抗HER2单克隆抗体VENTANA 4B5（用于HER2临床检测）的HER2染色模式进行比较，并使用已建立的方法学进行评分。

简要而言，5 μm石蜡切片经脱蜡和水化。进行抗原修复；封闭内源性过氧化物酶和非特异性蛋白结合位点[过氧化物酶封闭试剂（DakoCytomation）；Background Sniper (Biocare)]，然后与mAb104一抗（2.5 μg/mL，室温1小时）孵育，并使用链霉亲和素辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗（DakoCytomation）进行检测。

人体组织取自Austin Health解剖病理学系，其组织学诊断由病理学家确认。该IHC研究经Austin Health人类研究伦理委员会批准。

⁸⁹Zr标记mAb104的生物分布和分子成像研究

将携带已建立HER2阳性NCI-N87肿瘤的NOD-SCID-IL2R^?/?小鼠（Animal Research Center, Perth, Australia）通过尾静脉注射（0.1 mL）给予痕量剂量（185 kBq）的⁸⁹Zr-DFO-mAb104（合成结束时比活度A_s = 37 MBq/mg）。在注射后第0天（2小时）、1、2、3、5、7和9天，处死小鼠（n=5）（通过异氟烷麻醉过度吸入），并评估放射性标记mAb104在正常器官和肿瘤中的生物分布。在指定时间点，通过异氟烷过度吸入人道处死小鼠，并通过心脏穿刺放血，立即收集肿瘤和器官。所有样品在双通道γ闪烁计数器（Wizard; PerkinElmer）中计数。在每个时间点同时计数由注射材料制备的三份标准品，从而能够对数据进行放射性核素物理衰变校正。组织分布数据计算为每个时间点放射性标记构建体每克组织的平均±SD注射剂量百分比（%ID/g）。

在携带NCI-N87异种移植瘤的NOD/SCID gamma小鼠上进行⁸⁹Zr标记mAb104的体内PET成像。小鼠接受4.653 MBq ⁸⁹Zr-Df-mAb104（126.8 μCi）的剂量，并在注射后第0天（4小时）、第2天和第7天使用小动物相机（nanoScan PET/MRI相机，Mediso）进行PET和MRI成像。

细胞增殖实验

将细胞（1×10⁴）接种在血清耗竭培养基的96孔微孔板中，并使其贴壁过夜。第二天加入具有系列稀释度的抗体及适当对照，并收获一个板作为时间0（T=0）测量。剩余的细胞板孵育3至5天。使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑鎓（MTS）比色活力测定法（以MTS为底物，Promega）评估细胞活力。

体内研究

向NOD-SCID-IL2R^?/?小鼠（Animal Resources Centre, Perth, Australia）皮下注射5×10⁶个与Matrigel（BD Biosciences）混合的细胞。注射BT-474细胞的小鼠在24小时前植入雌激素 pellets（Belma Technologies）。将患者来源的肿瘤样本（14.06A.G3）手术植入小鼠的乳腺脂肪垫中。待肿瘤生长至约100 mm³大小，然后将小鼠随机分为不同治疗组。通过腹腔注射给予治疗，每次注射0.5 mg抗体，每周三次，持续3周。使用公式(L × W²)/2计算肿瘤体积，其中“L”代表较大肿瘤直径，“W”代表最小肿瘤直径。切除肿瘤异种移植组织并处理为福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）标本切片。

所有动物研究方案均经Austin Health动物伦理委员会批准（协议号# A2015/05297, A2019/05605, 和 A2022/05790），并按照澳大利亚《科学目的动物护理和使用实践规范》（第8版，2013年）进行。

反相蛋白阵列（RPPA）分析

从HER2过表达的NCI-N87胃肿瘤中提取蛋白，并如前所述进行反相蛋白阵列分析。简要而言，在治疗开始后第1周和治疗结束（第3周）时获取的肿瘤样本，使用RIPA裂解缓冲液（#9803, Cell Signaling Technology）通过匀浆进行裂解，该缓冲液补充了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Roche Applied Science, Cat. # 05056489001）。使用Pierce BCA蛋白检测试剂盒评估蛋白浓度并标准化至1 mg/mL，然后与2-巯基乙醇和SDS一起煮沸。将蛋白裂解液送至美国德克萨斯州休斯顿MD Anderson癌症中心进行分析。

内化分析

将NCI-N87细胞与10 μg/mL抗体在4°C下孵育1小时使其结合，然后在37°C下孵育指定时间。固定和透化细胞，抗体用Alexa Fluor 488、LAMP1 (#9091; clone D2D11; Cell Signaling Technology)和Hoechst染色。在Airyscan模式下使用Zeiss 980倒置共聚焦显微镜获取图像。使用405 nm二极管激光成像Hoechst（激发：345 nm，发射：478 nm），使用氩激光成像Alexa Fluor 488（激发：494 nm，发射518 nm），并使用二极管激光检测Alexa Fluor 568（激发：578 nm，发射：603 nm）。图像采集设置（激光功率，0.2%）在所有条件和细胞类型中保持相同。通过改变检测器增益设置来调整饱和度。所有图像均进行1 μm的Z轴切片。每个图像通道和切片单独重新着色、重建和处理，并使用ZEISS ZEN Blue软件（在Z切片上）和ImageJ进行等值面渲染。通过放大感兴趣区域（虚线）并对每个通道进行高分辨率z切片（1 μm切片）来创建插图。每个图像通道和切片单独重新着色、重建、处理和合并使用ImageJ软件。比例尺，20 μm。使用上述插图图像的z切片，并使用ZEISS ZEN Blue软件（Zeiss）上的3D等值面渲染功能创建三维表面渲染图像。比例尺，20 μm。

统计分析

使用Prism version 9进行分析。所有P值均为双侧，且值≤0.05被认为具有统计学显著性。

数据可用性

本研究产生的数据可根据要求从通讯作者处获得。

Results

mAb104的结合与特异性

生成了靶向HER2 ECD构象表位的新型抗HER2单克隆抗体：H-GCPLHNQEVTAEDGTQRC-NH₂通过半胱氨酸残基折叠成环并与KLH蛋白连接（补充材料）。使用单克隆抗体同种型分型试剂盒（Thermo Fisher Scientific）检测所选抗体的免疫球蛋白同种型，所有抗体均为IgG1，带有K轻链。进行了一系列结合实验，基于针对免疫原的初始结合和亲和力（K_D）测量结果（使用Biacore分析），我们选择了先导候选物mAb104进行进一步开发。使用ELISA检测，mAb104显示出对HER2 ECD最强的结合亲和力，以及对生成抗体所针对的环状和线性肽免疫原的结合（补充图S1）。此外，在HER2过表达[定义为IHC评分为2+或3+]的癌细胞系：乳腺癌（BT-474, SK-BR-3）、胃癌（NCI-N87）和肺癌（NCI-H2170）中，mAb104通过Western blot分析显示出最高的细胞HER2结合，而在低HER2表达的癌细胞系：乳腺癌（MCF-7）和肺癌（NCI-H838, NCI-H522, NCI-H1650）中则未显示结合。随后通过表面等离子体共振（Biacore）对HER2 ECD结合的分析表明，mAb104具有高亲和力结合（K_D为14 nmol/L），与曲妥珠单抗（K_D为0.1 nmol/L）和帕妥珠单抗（K_D为1.9 nmol/L）的结合亲和力相当。因此，选择mAb104作为我们的先导候选物进行进一步评估。

通过FACS比较mAb104与曲妥珠单抗和帕妥珠单抗在一组具有不同HER2表达水平的癌细胞系中的细胞表面结合。在评估的细胞系中，mAb104显示与所有高HER2表达的细胞系结合，其中与胃癌细胞系NCI-N87中的HER2群体结合最强，在低HER2表达的细胞系中观察到可忽略的HER2结合。在所有情况下，mAb104的结合始终低于帕妥珠单抗和曲妥珠单抗，表明至少在体外，mAb104表位暴露在一部分HER2受体上。

还通过IHC使用正常和肿瘤组织的组织芯片研究了mAb104与固定组织的结合。总共检查了11种正常人体组织和10种常见肿瘤类型（乳腺导管内癌、间皮瘤、结直肠和胃腺癌、肾细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、肝细胞癌、前列腺腺癌和GBM）的9至27个不同人类供体（代表性数据如图2E-I所示；补充图S3）。肿瘤和正常组织并非来自同一患者（即不匹配）。在所有情况下，与FDA批准的HER2对照抗体VENTANA相比，mAb104均未显示与正常粘膜的反应性，即使在HER2对照抗体显示显著结合的组织中（例如胃粘膜）。这些发现表明，尽管存在HER2表达，但mAb104所结合的表位在这些组织中并未暴露。相反，mAb104在各种肿瘤类型中结合HER2，且高度一致地证明了mAb104与HER2结合之间的关系。染色模式和IHC评分的详细信息可在补充表S1和S2中找到。

表位分析与竞争实验

通过同源建模的抗体Fv结构域三维结构和已知的人HER2 X射线结构，采用先前描述的方法，计算预测了104抗体可变结构域结合位于HER2结构域II上的抗原表位。将预测的mAb104与HER2的结合与已知的帕妥珠单抗和曲妥珠单抗与HER2结合的晶体结构进行了比较。预测mAb104的结合需要受体激活时发生的构象变化，如先前对EGFR所述，其中基于抗体mAb806的数据，HER2结构域II的二硫键可以动态地形成和断裂。

通过流式细胞术在HER2过表达的乳腺癌（BT-474和SK-BR-3）和胃癌（NCI-N87）细胞系中研究了mAb104与帕妥珠单抗和曲妥珠单竞争结合内源性HER2的情况。这组实验使用高剂量（100 μg/mL）的mAb104预孵育，以最大化看到对曲妥珠单抗和帕妥珠单抗结合影响的机会。预先用更高剂量的mAb104孵育并不影响曲妥珠单抗或帕妥珠单抗与细胞表面HER2的结合。在随后的ELISA实验中，曲妥珠单抗和mAb104互不影响对方与HER2-ECD的结合。类似地，预先用帕妥珠单抗孵育不影响mAb104结合；然而，有趣的是，预先用mAb104孵育减少了帕妥珠单抗与HER2-ECD的结合，表明mAb104与其表位的结合导致了对帕妥珠单抗与其自身表位结合的空间位阻，而不是实际竞争同一表位。流式细胞术和ELISA在mAb104与帕妥珠单抗竞争结果上的不一致归因于 assays 中抗原制备的技术差异，即流式细胞术分析时HER2处于其生理构象，而ELISA中部分变性，以及随之而来的表位呈现和可用性。

mAb104对体外增殖、ErbB受体及下游信号通路的影响

mAb104作为单药治疗在HER2过表达的乳腺癌细胞系（BT-474和SK-BR-3）和胃癌细胞系（NCI-N87和OE-19）中未显示任何体外活性。此外，在评估的细胞系中，将mAb104加入曲妥珠单抗并未增强与曲妥珠单抗单药治疗相比的抗增殖效应。在配体非依赖性和配体依赖性条件下，用mAb104处理乳腺癌（SK-BR-3和BT-474）和胃癌（NCI-N87和OE-19）癌细胞系，并未导致总HER2或磷酸化HER2量的变化，也未观察到下游信号的相关变化。

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