综述：弥漫性大B细胞淋巴瘤微小残留病检测

本文系统评述了弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）微小残留病（MRD）检测的最新进展，重点探讨了基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的液体活检技术（如ddPCR、NGS、PhasED-Seq等）在预测复发、监测疗效及指导个体化治疗中的临床价值，并指出标准化与前瞻性研究是未来发展的关键。

　　

Highlights

• 采用液滴数字PCR（ddPCR）和下一代测序（NGS）等技术检测弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的微小残留病（MRD），为预测复发和监测治疗反应提供了高灵敏度工具。

• 基于循环肿瘤DNA（ctDNA）的MRD检测相比传统影像学能更早发现疾病进展，有望指导治疗强化或降级策略。

• 表面增强拉曼光谱（SERS）和飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）等新兴技术展现出提升MRD检测灵敏度及拓宽临床应用的潜力。

Abstract

Purpose of review

弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）在复发和难治性背景下治疗困难。尽管约65%患者通过一线化疗治愈，仍有35%患者出现难治或复发，表明急需个体化治疗策略。本综述探讨了通过血液中循环肿瘤DNA（ctDNA）分析进行的MRD检测如何作为临床预后因素，预测复发并辅助治疗决策。

Recent findings

多种MRD检测技术如ddPCR和NGS被详细描述，强调其在理解患者治疗反应和评估风险水平中的重要性。

Summary

ctDNA分析有望指导医生更早干预，改善患者结局和生活质量。然而，技术标准化和临床整合仍是挑战。未来研究对突破这些障碍至关重要，以推动MRD检测在DLBCL管理中的广泛应用。

Introduction

DLBCL约占非霍奇金淋巴瘤的30%。当前一线治疗可治愈约65%患者，但许多患者经历复发或难治，需个体化治疗。现有影像学技术监测治疗反应缺乏足够灵敏度和特异性。MRD检测是许多血液恶性肿瘤治疗中的重要工具，尤其是急性淋巴细胞白血病（ALL），也是多种血液疾病（如急性髓系白血病AML、多发性骨髓瘤MM、慢性髓系白血病CML）管理的标准 care。它是独立于治疗方案的复发风险强预测因子。PCR、NGS和多参数流式细胞术（MFC）是当前MRD检测主要方法。MRD检测的另一潜在作用是治疗后监测。为改善DLBCL护理，迫切需要风险分类、反应评估和早期复发检测的新工具。本综述调查MRD检测技术、其当前应用及在DLBCL中使用的文献证据。

Literature Review Methodology

通过PubMed/MEDLINE和Google Scholar的布尔搜索使用相关关键词评估MRD检测在DLBCL中的作用。为确保全面性，未限制出版年份。文章聚焦于专门评估MRD在DLBCL中作用的研究，排除其他血液癌症。所选研究被综述和总结以回答关于MRD检测在DLBCL中的效能、方法和临床相关性等问题。

Methods for MRD Detection

液体活检是一种非侵入性癌症诊断和治疗监测方法，具有广泛接受度、准确预测肿瘤负荷和治疗反应及便于重复检测等优点。该技术通过分析循环肿瘤细胞（CTCs）、外泌体和细胞游离核酸（cfDNA）检测体液中的癌症生物标志物，如基因突变、融合、DNA甲基化、蛋白质和代谢物。cfDNA由细胞死亡时释放到血液中的小DNA片段组成，其中一小部分是来源于恶性肿瘤的ctDNA。检测ctDNA对癌症监测至关重要。主要有两种ctDNA检测技术：基于PCR的方法（如ddPCR）成本低、灵敏度高，但仅限于已知突变。ddPCR通过将DNA样本分成小液滴并进行PCR扩增，实现特定突变检测，检测限约0.1%，但临床效用受限于已知突变。NGS提供更灵敏和广泛的方法。基于扩增子的NGS是检测特定ctDNA分子的常用方法，成本效益高且快速，适合常规诊断工作流程。它扩增特定基因区域后测序，检测限低至0.01%，但可能对预选基因区域有偏好。Poh等研究显示，在0.1%变异等位基因频率（VAF）下，点突变检测灵敏度99.38%，插入缺失检测95.83%，非癌症样本中每碱基特异性≥99.9999%。但该技术突变检测仅限于目标扩增子区域。

杂交捕获基于NGS使用探针捕获特定DNA序列后进行测序，允许识别多个突变，即使无先验知识。该技术可检测低至0.02%的ctDNA。为全面ctDNA检测，流式细胞术和分子诊断提供诊断时肿瘤克隆的基因组和表型特征。流式细胞术通过突出肿瘤相关抗原谱分析表型，分子诊断聚焦识别肿瘤基因组异常。总之，ddPCR成本效益高但限于已知突变，而杂交捕获NGS更广泛、更灵敏。

phased变异富集与检测测序（PhasED-Seq）和癌症个性化深度测序分析（CAPP-Seq）是两种变革性方法。PhasED-Seq检测 phased变异（PVs），即同一DNA链上顺式发生的两个或多个突变。该方法增强错误抑制，显著提高回收效率。PhasED-Seq特别适用于DLBCL，其中体细胞超突变导致定型区域聚集突变，便于PVs检测。Kurtz等证明PhasED-Seq的优异错误谱，在极限稀释系列和临床样本中检测限低于1/1,000,000。CAPP-Seq使用杂交捕获探针靶向复发单核苷酸变异（SNVs），检测限约100 ppm，适合基线肿瘤分析和MRD监测。但其依赖单突变限制在超低肿瘤分数（<0.01%）下的灵敏度，错过25% DLBCL治疗后复发。Kurtz等研究中，88例患者样本59%用CAPP-Seq未检测到ctDNA，但PhasED-Seq在25%“阴性”病例中识别出ctDNA，揭示否则会遗漏的MRD。这些发现突显PhasED-Seq在改善DLBCL患者疾病检测中的效用，为个体化治疗决策提供更强基础。尽管PET-CT仍是DLBCL治疗结束（EOT）反应评估标准，但PhasED-Seq在ctDNA水平低至4/1,000,000时能比临床复发早10个月检测MRD，而PET-CT数月后才失败。

多色流式细胞术（MCFC）是检测白血病MRD的成熟方法，使用荧光标记抗体基于光散射（大小）和荧光发射（免疫表型）识别恶性细胞。MCFC检测残留CTCs，对套细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤和Burkitt淋巴瘤有用，但不适用于缺乏CTCs的DLBCL。

飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）是结合流式细胞术与质谱的新兴技术，涉及用稀有重金属同位素标记抗体，减少背景噪声并消除荧光方法的通道串扰问题，因此无需补偿计算。CyTOF已用于研究DLBCL肿瘤细胞免疫表型，可同时测量多达45个参数，显示出MRD检测潜力。但与荧光流式细胞术相比，由于样本和仪器处理中显著细胞损失导致评估细胞减少，灵敏度较低。

表面增强拉曼光谱（SERS）与拉曼光谱结合显示出监测DLBCL预后和追踪淋巴瘤患者MRD的前景，尽管其用于疾病进展期间MRD检测效用的研究有限。拉曼光谱依赖拉曼散射（光非弹性散射），SERS使用金属纳米结构增强这些分子信号。这种协同改善诊断能力，实现各种癌症疾病进展的有效监测。一项临床研究使用SERS分析健康个体和不同疾病阶段DLBCL患者血清样本的拉曼光谱，显示明显光谱强度差异和与疾病进展的强相关性。

Clinical Significance of MRD in DLBCL

识别高危DLBCL患者以改善结局仍具挑战性。国际预后指数（IPI）或“细胞起源”（COO）分类等因素已被用于识别高危患者和确定预后。多项研究评估了ctDNA作为预后生物标志物；一项前瞻性研究使用PhasED-Seq分析99例患者血浆样本（基线、3周期后中期C4D1、治疗结束EOT），获取肿瘤来源变异用于治疗后MRD监测。治疗前ctDNA高于中位水平的患者进展风险更高（风险比HR 2.7, P=0.004）和更差总生存（OS）（HR 5, P=0.0004）。中期（无进展生存PFS: HR 5, P=0.0002; OS: HR 4.1, P=0.0046）和EOT时间点（PFS: HR 7.8, P<0.0001; OS: HR=10.8, P<0.0001）类似关联。这些发现表明不同时间点可检测ctDNA是更差预后的强预测因子，对PFS和OS有显著影响。另一项使用淋巴瘤特异性NGS panel作为ctDNA检测方法对73例DLBCL患者的研究发现，治疗前ctDNA水平是患者结局的显著独立预测因子。较高ctDNA水平与较差PFS和OS相关。此外，2周期治疗后ctDNA显著减少的患者比无应答者PFS和OS更好。这些发现进一步强化ctDNA作为预测DLBCL治疗反应和长期结局的有价值生物标志物潜力。Kurtz等对75例DLBCL患者病程中外周血样本进行免疫球蛋白高通量测序（Ig-HTS）前瞻性评估，比较血浆Ig-HTS与乳酸脱氢酶（LDH）水平。血浆Ig-HTS疾病检测灵敏度88%，显著优于LDH的59%（P=0.01）。血浆Ig-HTS还与PET/CT评估的代谢肿瘤负荷相关，后者与患者结局相关。这些结果巩固ctDNA作为DLBCL患者有用生物标志物的可能性。

相反，另一项涉及85例DLBCL患者的前瞻性研究中，治疗前ctDNA水平在多变量分析中未保持对PFS和OS的预后价值。但数据表明高ctDNA水平（>2.5 log hGE/mL）与较低完全缓解率（65% vs. 96%; P<0.004）、较短2年PFS（65% vs. 85%; P=0.038）和OS（73% vs. 100%; P=0.007）相关。因此，尽管数据显示高ctDNA水平与更差临床结局相关，其独立预后意义可能因其他因素而异。

Merryman等评估了MRD预测自体移植（ASCT）后复发的价值。使用采集干细胞中免疫球蛋白高通量测序作为MRD标志物。中位ASCT后随访60个月，5年PFS为48%。23/98（23%）干细胞样本中检测到MRD，与非常差PFS（5年PFS 13% vs. 53%, P<0.001）和较差OS（52% vs. 68%, P=0.05）相关。MRD阳性对进展和死亡的灵敏度和特异性分别为36%和93%。阳性MRD在多变量分析中仍是PFS显著预测因子（HR 3.7; P<0.001）。这些发现突显移植背景下MRD的预后价值。另一项研究评估了ctDNA在嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗Axicabtagene ciloleucel前的价值。较高治疗前ctDNA与较高进展风险、细胞因子释放综合征（CRS）和免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）相关。

Impact of MRD on Treatment Decisions

治疗后系列影像学显示无生存获益。一项包括680例DLBCL患者的回顾性研究证明，治疗结束后放射学CT扫描调查与标准临床评估相比未改变患者结局。循环DNA可在临床症状和影像学前预测疾病复发。一项研究通过连续采用ctDNA水平监测治疗后疾病状态，监测ctDNA显示阳性预测值（PPV）88%和阴性预测值（NPV）98%。监测期间发展可检测ctDNA的患者发生临床进展的风险比无可检测ctDNA患者高228倍。检测领先时间（即ctDNA检测复发早于CT影像的中位时间）为3.5个月。较早检测进展是否会改变患者结局尚不清楚；需要前瞻性研究评估较早复发检测对患者结局的优势。

MRD-Guided Therapy Strategies

多项研究强调治疗过程中ctDNA监测调整治疗策略的潜力。一些研究前瞻性追踪治疗期间ctDNA，表明治疗过程中监测ctDNA可能允许治疗调整。最近一项临床试验使用ctDNA水平测量DLBCL患者用panobinostat治疗的反应率。14例进展患者中10例显示ctDNA水平增加，与无反应强相关，灵敏度71.4%，特异性100%。Rossi等使用panel-directed NGS纵向分析50例接受利妥昔单抗-环磷酰胺-多柔比星-长春新碱-泼尼松（R-CHOP）治疗的DLBCL患者的127份血浆样本。样本分析显示应答者cfDNA中DLBCL突变快速清除。相反，R-CHOP耐药患者中，基础DLBCL突变未从cfDNA消失。此外，治疗耐药患者中，cfDNA中获得新突变，标记克隆进化期间选择的耐药克隆。

DLBCL患者中，NGS量化的MRD水平与传统肿瘤负荷指标如疾病分期、LDH水平和PET-CT代谢肿瘤体积相关。Scherer等研究描述，使用panel-directed NGS检测的较高治疗前ctDNA水平对应较差PFS。因此，这表明治疗前ctDNA在DLBCL中可能作为潜在预后生物标志物。它也可能用于识别高危患者群体，适合纳入评估强化治疗策略（如标准R-CHOP添加新药）的临床试验。此外，NGS还检测肿瘤特异性突变，可 enable 选择患者进行靶向治疗。因此，这表明MRD检测可能在定制治疗策略和推进患者个体化治疗中发挥作用。

Current Research and Developments

ctDNA enable 淋巴瘤基因分型和MRD检测。一项R-CHOP治疗DLBCL患者的研究中，使用NGS测量ctDNA水平，显示高治疗前ctDNA水平与晚期疾病和较短PFS相关。2周期治疗后，达到主要分子反应（MMR）的患者2年PFS显著更好（76% vs. 0%），结合ctDNA减少与PET/CT结果进一步增强预后分层，突显ctDNA监测改善结局预测的价值。一项评估ctDNA在淋巴瘤（尤其是DLBCL）中预后价值的meta分析回顾8项研究767例患者。分析显示高ctDNA水平与较差PFS（HR 2.24, 95% CI 1.63-3.08, P<0.00001）、无事件生存（EFS）（HR 4.53, 95% CI 1.79-11.47, P=0.001）和OS（HR 3.09, 95% CI 1.50-6.35, P=0.002）显著相关。这些发现证明ctDNA是淋巴瘤（尤其是DLBCL）中有用预后生物标志物，尽管需要更多研究确立其在临床环境中的精确角色。

Kurtz等2019年研究探索如何连续监测肿瘤生物标志物（特别是ctDNA）用于动态风险分析以预测DLBCL患者个体化治疗结局。作者介绍连续个体化风险指数（CIRI），一种机器学习驱动模型，整合连续液体活检数据（如ctDNA水平）与临床变量以实时动态更新癌症预后。CIRI通过追踪ctDNA动力学（如治疗后周期对数减少）预测DLBCL复发风险，识别需要早期干预患者并指导适应性临床试验设计，优于静态风险模型如IPI。此外，该模型通过利用错误校正测序检测<0.01%肿瘤分数的ctDNA，实现更早MRD检测并减少过度治疗，解决PET-CT局限性（如炎症相关假阳性导致低阳性预测值）。通过连续重新校准风险概率，CIRI将ctDNA引导治疗定位为精准肿瘤学的基石。

Challenges and Limitations in MRD Assessment

淋巴瘤基于ctDNA的MRD评估关键挑战包括需要实时数据与快速周转时间、方法标准化和前瞻性试验数据生成以定义最佳时机和基于MRD的治疗改变最佳行动。与实体瘤成熟测定不同，淋巴瘤无标准化、临床可用ctDNA测定。此外，不同ctDNA测定灵敏度、检测限和预期用途的变异性使广泛实施复杂化。标准化这些特征对ctDNA可靠追踪疾病进展和组织学转化（如低级别向高级别淋巴瘤）至关重要。另外，成本和可及性问题可能限制其即使批准后的广泛采用。实验室间缺乏标准化目前限制ctDNA分析在多中心试验和国家间的广泛使用。为解决此，发起“ASH年会ctDNA工作组会议”和“2019年15-ICML ctDNA研讨会”等倡议，以建立预分析处理、panel设计、测定性能和生物信息学标准。这些努力旨在协调液体活检技术并改善其全球实施。此外，2023 ASH年会提供MRD检测更新证据。血浆基于ctDNA分析在复发预测中显示优于PET/CT，PhasED-Seq检测超低水平（<0.0001% VAF）高危患者，被标准方法遗漏。证据显示治疗结束时，ctDNA-MRD在结局分层中优于PET/CT，MRD阴性患者2年总生存达93%对比MRD阳性38%。因此，这些结果强调ctDNA-MRD作为DLBCL风险分类和治疗推荐强效工具的治疗相关性日益增长。

Conclusion

总之，整合MRD检测与DLBCL治疗代表改善患者结局的积极一步。基于文献，MRD检测通过提供疾病负担洞察和使用NGS检测肿瘤特异性突变以辅助选择靶向治疗患者，可能 hold 定制治疗策略的 promising 潜力。尽管初步发现鼓舞人心，使用MRD和ctDNA个体化DLBCL治疗仍在调查中，应在未来临床试验中更好探索。然而，许多重要问题仍未解答。MRD检测方法仍需标准化和澄清如何良好解释结果以有效指导治疗决策跨实验室。此外，未来研究需要解决此证据以使MRD检测在DLBCL常规管理中广泛接受和使用。标准化MRD方法和解决研究差距将使精准医学成为DLBCL管理的常规元素。

Financial Support and Sponsorship

无。

CRediT authorship contribution statement

Miral Atout: 撰写初稿、方法学、概念化。Hadeel Elwaheidi: 撰写初稿、方法学。Rand Maarouf: 撰写初稿、方法学。Abdulwahab A. Albabtain: 评审编辑。Saud Alhayli: 评审编辑。Alfadel Alshaibani: 评审编辑。Mahmoud Aljurf: 评审编辑。Riad El Fakih: 评审编辑。

Disclosure

作者声明无利益冲突。

Acknowledgments

本研究未从公共、商业或非营利部门获得任何特定资助。