木霉与增殖镰刀菌的种间拮抗作用：基于代谢组学与DNA分析的生物防治机制研究

本研究针对镰刀菌病害对谷物生产的严重威胁，探索了八株木霉对产毒能力不同的两株增殖镰刀菌的拮抗作用。通过固体与液体共培养实验，结合数字PCR与高分辨质谱技术，发现特定木霉菌株（如T. atroviride AN153、AN215、AN523）可显著抑制病原菌生长，并降低伏马毒素（FB1、FB2、FB3）和 beauvericin（BEA）的生物合成，揭示了其通过竞争营养、代谢干扰及可能的多机制协同实现生物防治的潜力，为开发绿色防控剂提供了理论依据。

　　

近年来，谷物生产深受镰刀菌（Fusarium）病害的困扰，这些病原真菌不仅直接导致作物减产，更严重的是其产生的霉菌毒素——如伏马毒素（fumonisins）和 beauvericin（BEA）——对全球食品安全和农业可持续性构成显著风险。随着气候变化、单一作物种植模式的推广以及种质资源全球化交流的加剧，镰刀菌的发生率不断上升，尤其在玉米、水稻和高粱等主要谷物中尤为突出。在波兰等欧洲国家，虽然增殖镰刀菌（Fusarium proliferatum）并非小麦的主要病原体，但却是玉米中常见的污染源，其产生的伏马毒素（包括FB₁、FB₂和FB₃）和BEA因具有干扰鞘脂代谢、诱导细胞毒性等作用，受到欧盟严格监管（例如FB₁+FB₂在未加工玉米中的限量为4000 μg/kg）。化学杀菌剂虽然短期内有效，但易导致病原体抗性、环境污染和残留问题，因此，寻求环境友好的生物防治策略成为研究热点。木霉（Trichoderma）作为常见的拮抗真菌，具有竞争营养、寄生作用、诱导植物系统抗性和产生抗真菌代谢物等多重机制，但其具体拮抗效果及对霉菌毒素生物合成的调控机制尚不明确，尤其在不同菌株间的差异及分子基础仍需深入探索。

本研究发表在《Journal of Applied Genetics》，旨在评估八株木霉分离株（包括T. viride、T. viridescens和T. atroviride）对两株产毒潜力不同的增殖镰刀菌（PEA1和PEA2）的拮抗能力，重点关注其对真菌生长、霉菌毒素产生及代谢组学 profile 的影响。通过采用固体共培养（PDA培养基）和液体共培养（Czapek-Dox broth）实验，结合数字PCR（dPCR）定量病原菌DNA、超高效液相色谱-高分辨质谱（UHPLC-HRMS）分析毒素含量以及非靶向代谢组学分析，研究揭示了木霉菌株的特异性拮抗作用及其潜在机制。

为开展研究，作者主要应用了以下几项关键技术方法：一是基于固体培养基的双菌对峙培养与生长抑制分析，用于直观评估木霉对镰刀菌菌丝扩展的抑制效果；二是以大米固体基质模拟天然感染环境进行共培养，并结合数字PCR（使用特异性引物Proli1F/TEF1R）定量病原菌生物量，以准确反映生物防治中的菌群动态；三是利用UHPLC-HRMS技术对伏马毒素（FB₁、FB₂、FB₃）和BEA进行精确定量与代谢物鉴定；四是通过非靶向代谢组学（采用Compound Discoverer软件）分析共培养体系中的代谢 profile 变化，识别潜在的功能性代谢物；此外，还通过液体培养条件下的毒素降解实验评估了木霉的直接代谢活性。所有样本来源于波兰科学院植物遗传研究所的菌种保藏库，实验设三次生物学重复，数据经ANOVA和Tukey HSD检验确保统计可靠性。

Antagonistic properties

在PDA平板对峙培养中，木霉菌株显示出对增殖镰刀菌生长的显著抑制，且抑制效果因菌株组合而异。T. atroviride菌株（AN153、AN215、AN523）表现最优，对产毒较低的PEA2抑制率最高达70%，而对产毒较强的PEA1抑制效果相对较低（最低仅20%）。视觉观察显示，木霉在接触区可覆盖病原菌菌丝并促进自身孢子形成，部分组合中甚至引起病原菌色素变化。数字PCR进一步证实，有效木霉菌株（如AN153、AN215、AN523）在共培养中几乎完全减少了镰刀菌DNA含量（接近100%），而AN705反而促进了PEA1的生长（DNA增加31.7%），表明拮抗作用具有高度菌株特异性。

Inhibition of Fusarium toxin biosynthesis by Trichoderma

在固体大米基质共培养中，两株镰刀菌呈现不同的产毒特性：PEA1产生的FB₁、FB₂和FB₃分别比PEA2高12倍、10倍和5倍，而PEA2的BEA产量是PEA1的三倍。有效木霉菌株（AN153、AN215、AN523）几乎完全抑制了所有毒素的积累，但AN705与PEA1共培养时反而增加了FB₁、FB₂和FB₃的水平。Pearson相关性分析显示，病原菌DNA浓度与FB₁、FB₂和BEA含量呈极显著正相关（r > 0.9, p < 0.001），表明毒素减少主要源于生物量抑制而非直接降解。液体培养中添加FB₁的实验进一步验证木霉无法直接降解该毒素，说明固体基质中的毒素减少可能源于环境因素或病原菌自身代谢调节。

Metabolomics analysis

非靶向代谢组学揭示了共培养体系中代谢物的显著变化。PCA分析显示，AN153和AN215引起PEA1和PEA2代谢 profile 的明显分离，与其它菌株相比更接近对照组，表明其强拮抗效应。在共培养提取物中检测到多种潜在功能性代谢物，包括铁载体 coprogen B、有机酸（柠檬酸、异柠檬酸）、酚酸（咖啡酸、阿魏酸）、茉莉酸以及6-戊基-2H-吡喃-2-酮（6PP）。这些化合物在木霉单培养中已有出现，而在与PEA1/AN215或PEA2/AN153共培养中响应增强，提示它们可能通过酸化环境、竞争铁源或直接抑制病原菌细胞壁合成参与拮抗过程。例如，coprogen B可能通过剥夺铁资源抑制镰刀菌生长，而6PP和酚酸类物质已知具有直接抗真菌活性。

研究结论表明，木霉对增殖镰刀菌的拮抗作用呈菌株特异性，其中T. atroviride（AN153、AN215、AN523）表现最为优异，能同步抑制病原菌生长和毒素积累。这种效应主要源于生物量竞争而非毒素直接降解，且受病原菌产毒特性调控——高毒力菌株（如PEA1）可能通过应激响应（如MAPK信号通路激活）部分抵消拮抗效果。代谢组学结果进一步提示，木霉可能通过分泌多种次级代谢物（如铁载体、有机酸、抗菌化合物）实现多机制协同防治。该研究强调了开发基于木霉的生物防治剂时需考虑病原菌-拮抗菌株特异性互作，并为减少谷物中霉菌毒素污染提供了实践方向。未来研究应聚焦于关键代谢物的鉴定、毒素降解的分子机制以及田间应用条件的优化，以推动绿色农业和食品安全策略的发展。