靶向清除上皮小细胞外囊泡的有机片状纳米平台在治疗过敏性气道炎症中的应用

本综述创新性地开发了一种功能化“无机组分”纳米片（PNSE），通过靶向清除上皮源性小细胞外囊泡（sEVs）以缓解过敏性气道炎症。研究证实，PNSE可高效结合sEVs并抑制其介导的STING通路激活、树突状细胞（DC）成熟及嗜酸性粒细胞胞外诱捕网（EET）形成，同时在体内展现出优异的生物相容性、气道靶向性及抗炎效果。该研究为过敏性鼻炎（AR）和哮喘等过敏性气道疾病的纳米药物治疗提供了新策略。

　　

1 引言

过敏性气道疾病（AAD），如过敏性鼻炎（AR）和支气管哮喘，已成为影响全球超过10亿人健康的重大公共卫生问题。这类疾病主要由2型免疫反应驱动，表现为免疫细胞浸润、黏液过度分泌及气道高反应性。气道上皮作为人体接触吸入性过敏原的第一道屏障，其受损后释放的小细胞外囊泡（sEVs）在炎症放大过程中扮演关键角色。近期研究发现，上皮源性sEVs可激活下游炎症信号通路，加剧过敏反应。临床样本分析显示，AR患者鼻分泌物中sEVs及双链DNA（dsDNA）水平显著高于健康人群，且与炎症严重程度呈正相关。

当前临床治疗AAD的主要手段如糖皮质激素和抗组胺药物疗效有限，且均未针对上皮sEVs这一关键炎症介质。近年来，纳米技术的发展为 refractory 气道疾病提供了新治疗策略。二维纳米材料因其灵活的平面结构及多重相互作用，在sEVs捕获方面展现出独特优势。然而，传统无机纳米片（如石墨烯、黑磷等）的生物相容性差、难以降解等问题限制了其临床转化。相比之下，有机聚合物材料通常具有更优异的生物相容性和较低的免疫原性。

基于此，本研究旨在构建一种“无机组分”的二维纳米平台，通过降解无机骨架制备聚甘油胺（PG）纳米片（PNS），并修饰表皮生长因子受体适配体（Apt_E）以增强其对上皮sEVs的靶向结合能力。该功能化纳米平台（PNS_E）不仅具备sEVs清除功能，其残留的巯基还可中和活性氧氮物种（RONS），进一步缓解炎症反应。

2 结果

2.1 AR患者鼻分泌物中sEVs数量与dsDNA水平分析

通过对20例AR患者和20例健康志愿者鼻分泌物的分析发现，AR患者sEVs数量（2.9±1.6×10⁸ particles/mL）及dsDNA浓度（551±383 ng/mL）均显著高于健康组。纳米颗粒追踪分析（NTA）、动态光散射（DLS）和透射电镜（TEM）结果证实sEVs的粒径约为100 nm，zeta电位为-8 mV。相关性分析显示，sEVs数量与炎症细胞因子IL-4（r=0.52）和IL-5（r=0.56）水平呈显著正相关，表明sEVs与过敏性炎症密切相关。

2.2 过敏原激发的sEVs加剧气道炎症

用屋尘螨（HDM）处理原代小鼠上皮细胞后，发现sEVs释放量显著增加。将这些sEVs（sEVs(H)）与骨髓来源树突状细胞（BMDCs）共培养后，CD11c⁺/CD86⁺/CD80⁺细胞比例升高至41±4.4%（对照组为18.7±3.6%），MHC II⁺细胞比例也显著增加。STING抑制剂C-178可抑制sEVs诱导的DC成熟，表明cGAS-STING通路在此过程中起关键作用。此外，sEVs(H)还能促进嗜酸性粒细胞释放ECP并形成EETs，该效应也可被C-178部分抑制。

动物实验进一步证实，使用中性鞘磷脂酶抑制剂GW4869抑制sEVs生成后，HDM诱导的小鼠鼻腔和肺部炎症显著减轻；而额外滴注sEVs则加剧炎症反应。但由于GW4869的毒性副作用，其临床应用受限。

2.3 有机片状纳米平台的合成与表征

通过锂离子插层法合成TiS₂单层纳米片，经酰胺化反应连接PG分子，交联后使用辣根过氧化物酶（HRP）降解无机模板，最终获得“无机组分”的PNS。Western blot证实上皮sEVs表面EGFR高表达，因此通过修饰Apt_E构建靶向纳米片PNS_E。

原子力显微镜（AFM）显示PNS呈片状结构，平均尺寸183±91 nm，高度8.4 nm。X射线光电子能谱（XPS）分析证实TiS₂模板被完全降解。细胞毒性实验表明，PNS和PNS_E在1000 μg/mL浓度下仍保持60%以上细胞活力，显著优于含无机成分的TP材料。

2.4 PNS_E的sEVs结合与抗氧化能力

共聚焦显微镜观察显示，PNS_E与PKH67标记的sEVs具有显著共定位（Pearson's r值较高），定量结合实验表明其结合效率达80%。蛋白质吸附实验证实PG基材料具有低非特异性吸附特性。在HEK-STING细胞模型中，PNS_E处理使sEVs诱导的STING激活降低至60%。此外，DPPH和羟基自由基清除实验证明PNS和PNS_E具有显著抗氧化活性，能有效降低HDM刺激的RPMI2650细胞中活性氧水平。

2.5 PNS_E抑制DC活化与EET形成

细胞摄取实验表明，PNS_E在复杂细胞内环境中仍能保持与sEVs的稳定结合。流式细胞术分析显示，PNS_E处理使sEVs诱导的CD11c⁺/CD80⁺/CD86⁺细胞比例降至31.3±2.3%（sEVs组为62.6±7.8%），CD11c⁺/MHC II⁺细胞比例也显著降低。同时，PNS_E将sEVs引发的ECP阳性面积从15.7±2.8%降至5.4±3%，证明其能有效抑制EET形成。

2.6 纳米片给药后的体内分布

体内安全性评价显示，PNS_E即使以大剂量（10 mg/次）经鼻腔给药后，主要器官也未发现明显损伤，肝功能指标正常。Cy5标记的纳米片在体内分布研究表明，PNS_E在炎症气道组织中优先积累，且主要分布于鼻腔和肺部，其他器官几乎无检测信号。3D共聚焦图像显示PNS和PNS_E在鼻部和肺组织中的渗透深度优于PG_E。

2.7 PNS_E治疗缓解上下气道炎症

在HDM诱导的小鼠过敏性炎症模型中，PNS_E处理使鼻腔灌洗液（NALF）中sEVs和dsDNA水平分别降低至76.5%和77.2%，支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞因子（IL-4、IL-5、TSLP、TNF-α）水平显著下降。组织免疫染色显示，PNS_E治疗使鼻黏膜和肺部IL-5、ECP阳性面积分别减少69%和55.4%，杯状细胞增生、嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润也显著减轻。

流式细胞术结合t-SNE分析表明，PNS_E处理使肺部炎症区域总免疫细胞浸润从53.6±5.7%降至22±5.4%，其中DCs和T淋巴细胞分别减少66.2%和58.4%。细胞角蛋白（CK-5和CK-13）染色证实PNS_E有助于上皮完整性修复。

2.8 转录组分析

RNA测序结果显示，HDM+PNS_E处理组基因表达谱与生理盐水组高度相似，而与HDM组差异显著。差异表达基因（DEGs）分析发现，PNS_E处理逆转了HDM引起的1273个基因表达变化。KEGG通路分析显示，细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等炎症相关通路在PNS_E处理后显著下调。GO生物学过程分析表明，白细胞趋化、粒细胞迁移、炎症反应等过程受到抑制。GSEA分析进一步证实，胞质DNA感知通路、TNF信号通路等在PNS_E治疗后活性降低。

3 讨论

本研究首次证实上皮源性sEVs及其携带的dsDNA在过敏性气道炎症中的关键作用，并创新性地开发了靶向清除sEVs的有机纳米平台。与传统无机纳米材料相比，PNS_E具有优异的生物相容性和可降解性，其二维平面结构和Apt_E修饰赋予其高效sEVs结合能力。机制研究表明，PNS_E通过抑制sEVs介导的cGAS-STING通路激活，进而抑制DC成熟和EET形成，同时其抗氧化特性有助于缓解氧化应激。

体内实验证明，PNS_E能特异性聚集于炎症气道组织，有效降低sEVs和dsDNA水平，调节免疫细胞浸润，减轻上下气道炎症反应。转录组分析从分子水平揭示了PNS_E对多种炎症信号通路的调控作用。该研究为过敏性气道疾病的治疗提供了新思路，具有重要的临床转化价值。

4 结论

本研究成功开发了一种功能化有机纳米片PNS_E，能高效靶向清除上皮源性sEVs，并通过抑制STING通路激活缓解过敏性气道炎症。该纳米平台具有良好的生物相容性、气道靶向性和抗炎效果，为AR和哮喘等过敏性疾病的治疗提供了新策略。研究还强调了二维纳米结构和靶向适配体在sEVs清除剂设计中的重要性，为后续相关纳米药物开发提供了重要参考。

5 实验方法

本研究涉及临床样本采集、纳米材料合成、细胞实验、动物模型建立及多种分子生物学分析技术。所有实验均遵循相关伦理规范，统计分析采用GraphPad Prism 10软件进行，数据以均值±标准差表示，采用t检验或ANOVA进行组间比较。