靶向NF-κB介导的铜稳态破坏可增强乳腺癌对铜死亡（Cuproptosis）的敏感性

本研究揭示了铜（Cu）通过直接结合转化生长因子β激活激酶1（TAK1）增强NF-κB通路，进而促进TRAF2介导的TAK1泛素化与激活，导致IKKβ活化并介导铜的炎症和致癌功能。同时，NF-κB通过转录负调控铜转运蛋白1（CTR1）表达以维持铜稳态。靶向NF-κB不仅可与铜螯合剂（TTM）协同克服耐药性和铜增生（Cuproplasia），还可与铜离子载体（ES）联合促进铜死亡（Cuproptosis），为慢性炎症驱动的癌症提供双重干预策略。

　　

引言

慢性炎症是多种癌症（包括乳腺癌和肝细胞癌）发生的主要驱动因素。其中，NF-κB通路在由TNFα和IL-6等细胞因子以及LPS等病原体应激触发的慢性炎症中起核心作用。然而，NF-κB抑制剂在抑制全身免疫反应方面的副作用限制了其在癌症治疗中的应用。因此，确定NF-κB信号的上游调控和耐药机制将为炎症驱动的癌症提供新的靶点和潜在策略。

近年来，铜在肿瘤发生中的复杂作用逐渐被揭示。一方面，铜摄取增加可通过直接结合并激活下游致癌蛋白（如MAPK、AKT和ULK1）来增强肿瘤发生（称为铜增生），从而促进黑色素瘤、非小细胞肺癌和乳腺癌的发展。另一方面，过量铜摄取（包括使用铜离子载体如elesclomol（ES）和双硫仑（DSF））可诱导一种新型凋亡（即铜死亡），该过程依赖于铜转运蛋白1（CTR1）或锌转运蛋白1（ZnT1）的存在。然而，铜维持稳态的机制及其对铜增生和铜死亡的调控作用在癌症治疗中仍 largely elusive。

尽管铜螯合剂四硫钼酸铵（TTM）在癌症治疗中的潜在作用已被探索，但其主要受益于CTR1扩增的患者，鉴于CTR1改变率较低，铜螯合剂治疗的患者分层仍需进一步探索。CTR1表达在转录水平受缺氧诱导因子（HIF）或C-Myc等因子调控，同时在翻译后水平受AMPK介导的磷酸化调控，表明AMPK激动剂（如二甲双胍）与铜螯合剂联合用于乳腺癌干预的潜力。然而，其他上游调控铜摄取的机制，特别是控制CTR1水平的机制，仍知之甚少，这可能为与铜死亡协同治疗癌症提供有前景的策略。

铜-CTR1轴激活NF-κB通路发挥致癌作用

通过RNA测序方法，观察到铜给药或其转运蛋白CTR1的缺失与感染和炎症密切相关，包括NF-κB和TNFα通路的正调控。铜刺激显著增加了不同细胞系中NF-κB的活性，表现为IκBα和p65的磷酸化，且呈剂量依赖性。铜螯合剂TTM或CTR1缺失显著降低了铜诱导的NF-κB激活。铜诱导的p65核定位及其下游靶基因（如TNFα、IL-6和IL-1β）的表达被TTM处理减弱。

为了研究铜是否介导NF-κB的致癌作用，强制表达了NF-κB的中心激酶IKKβ，无论CTR1是否存在。结果显示，IKKβ显著增强了乳腺癌细胞的集落形成、软琼脂生长和癌细胞增殖，这些效应可被CTR1缺失减弱，表明NF-κB通路在介导铜致癌功能中的潜在作用。

铜对TNFα或LPS诱导的NF-κB激活至关重要

鉴于TNFα、LPS和病毒感染是NF-κB通路的典型激活因子，研究了铜是否影响这些典型上游调节因子。有趣的是，CTR1缺失大大减弱了TNFα和LPS在乳腺癌细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）中诱导的NF-κB激活。同样，TNFα和LPS或强制表达IKKα/β诱导的NF-κB激活容易被TTM给药抑制。此外，p65核定位及其下游靶基因（如TNFα、IL-6和IL-1β）在TTM处理或CTR1缺失后被强烈阻断。

在基于LPS的急性感染小鼠模型中，TTM显著降低了LPS诱导的NF-κB激活和对肺和肾的急性损伤，提高了小鼠存活率。这些发现表明，铜-CTR1轴对于典型细胞因子或病原体诱导的NF-κB激活至关重要。

铜-CTR1通过激活NF-κB通路提升PD-L1表达

基于先前报道的铜与PD-L1表达的联系，研究了铜是否以及如何调节PD-L1。为此，使用了不同的抑制剂来阻断铜调节的通路，包括MAPK、AKT和NF-κB，并观察到这些抑制剂可能减弱铜诱导的PD-L1表达，同时抑制NF-κB信号（PD-L1的一个成熟上游调节因子）。因此，铜诱导的NF-κB激活在体外和体内对促进PD-L1表达起主要作用，伴随MMTV-PyMT小鼠乳腺肿瘤中CD8⁺细胞的增加，而这些效应被铜螯合剂TTM或CTR1缺失显著逆转。

与此一致，TTM或CTR1缺失可废除TNFα或LPS通过抑制NF-κB通路诱导的PD-L1表达。在LPS诱导的小鼠模型中，TTM可有效降低不同组织中的PD-L1表达。有趣的是，CTR1表达在转录水平与多种癌症（包括乳腺癌）中的PD-L1表达呈正相关。同时，在乳腺癌组织中观察到CTR1和PD-L1表达的紧密正相关，两者在癌旁正常组织中表达均较低。

在鼠乳腺癌症E0771细胞中使用TTM处理的乳腺癌同系小鼠模型中，CD8⁺细胞大量增加，伴随PD-L1表达减少，表明铜在促进NF-κB激活及其下游PD-L1表达中的潜在作用，从而赋予癌细胞免疫逃逸。接下来，使用了离体T细胞为基础的细胞毒性 assay，并观察到预处理乳腺癌细胞 with TTM或携带CTR1缺失可促进T细胞介导的肿瘤杀伤效应。这些发现共同证明，铜-CTR1轴部分通过激活NF-κB介导的PD-L1表达来调节肿瘤免疫反应，促进肿瘤免疫逃逸。

铜直接结合TAK1激活IKKβ介导的NF-κB信号

尽管先前报道显示铜可调节XIAP以影响NF-κB信号，但在XIAP缺失细胞中，仍发现铜介导的NF-κB信号激活。因此，探索了铜激活NF-κB通路的潜在机制。铜增强了细胞中IκBα（NF-κB通路的负调节因子）的磷酸化，伴随IKKβ磷酸化的容易增强，而对IKKα/IKKβ/NEMO复合物的形成没有影响。

由于铜直接结合和激活激酶的潜力，特别是MEK，将TAK1的氨基酸与MEK1的激酶结构域进行了比对，类似于先前在ULK1中鉴定铜结合位点的方法。因此，TAK1中的两个组氨酸和蛋氨酸残基（H154和M196）被虚拟对接与MEK1作为铜潜在结合残基。生成了非结合突变体（H154A和/或M196A），并观察到与完整物种相比，突变体TAK1与铜的相互作用显著降低，无论是在细胞中还是在体外。同时，铜诱导的TAK1与IKKβ的相互作用，而不是与TAB1或TAB2的相互作用，被TTM或在铜结合缺陷的TAK1中显著废除。

有趣的是，尽管铜在细胞中诱导TAK1磷酸化IKKβ，但在管中添加铜进行激酶反应时并不抑制TAK1激酶活性，表明铜的结合不影响体外TAK1激酶活性。

铜结合TAK1增强TRAF2介导的与TAK1的相互作用和泛素化以激活NF-κB通路

泛素修饰在NF-κB激活中起主导作用，特别是肿瘤坏死因子受体相关因子（TRAFs）介导的K63连锁泛素。TAK1的重度泛素修饰其特征是与上游调节因子和下游效应物的相互作用。因此，检测了铜是否影响TAK1泛素化。结果显示，铜显著增强了TAK1 K63连锁泛素化，而铜结合缺陷突变体（2A）阻断了铜诱导的TAK1泛素化。

有趣的是，与铜在TNFα介导的NF-κB激活中的 essential 作用一致，TNFα在野生型而非突变体TAK1（2A）中提升了K63连锁泛素化，表明铜在促进TAK1泛素修饰中的潜在作用。此外，检测了TAK1的成熟E3连接酶，并观察到铜增强了TAK1与TRAF2的相互作用，而不是与TRAF6的相互作用，这可被TTM给药容易废除。而且，铜可直接在体外增强TAK1与TRAF2的相互作用，而铜结合缺陷突变体阻断了它们的相互作用。

这些发现共同表明，铜结合TAK1以招募TRAF2并促进TAK1泛素化，导致TAK1结合IKKβ并激活NF-κB通路。

接下来，检测了2A-TAK1的效果，并观察到这些突变体不仅阻断铜诱导的NF-κB激活，还抑制了TNFα诱导的NF-κB激活。进一步生成了携带不同TAK1突变体的细胞，并观察到突变体TAK1（HM至AA）降低了其在铜或TNFα刺激下磷酸化IKKβ以激活NF-κB通路的能力。结果，这些TAK1突变体缺陷了TAK1的致癌功能，以促进癌细胞增殖、体内肿瘤生长，并提升p65下游靶基因（如TNFα、IL-6和IL-1β）。

因此，这些发现共同表明，TAK1是铜的结合伙伴，以介导铜诱导的IKKβ-NF-κB激活。

NF-κB负调控CTR1表达

尽管CTR1受C-Myc和HIF在转录水平调控，以及受AMPK和Nedd4l在翻译后水平调控的报道，但NF-κB是否调节CTR1表达和调制铜摄取尚未定义。使用NF-κB抑制剂，观察到CTR1蛋白水平和铜摄取的显著增加，伴随CTR1 mRNA的增加。此外，通过遗传删除IKKβ或强制表达负性形式IκBα（DN）抑制NF-κB通路，增强了CTR1表达和铜摄取，伴随CTR1 mRNA水平的增加。

相反，用TNFα或LPS激活NF-κB通路，或异位表达IKKβ，显著降低了CTR1表达和膜定位，而NF-κB抑制剂恢复了TNFα或LPS降低的CTR1表达和膜定位。同时，异位表达IKKβ介导的CTR1表达减少不能被蛋白酶体或自噬抑制剂抑制。这些发现表明NF-κB通路在转录水平对CTR1的负调控。

为了揭示NF-κB调控CTR1表达的潜在机制，观察到NF-κB在转录水平抑制CTR1表达，并且p65（典型的NF-κB转录因子）缺失显著增加了CTR1表达在蛋白和mRNA水平，以及提升了铜摄取。因此，假设p65作为转录因子负调控CTR1表达。

为了评估p65是否直接调控CTR1表达，分析了先前建立的抗p65为基础的ChIP测序结果，并发现p65确实直接结合到CTR1（SLC31A1）的启动子区域，且结合亲和力在IL-1β刺激下进一步增加。接下来，通过ChIP-qPCR验证了p65与SLC31A1启动子的结合，以IL-1β启动子作为阳性对照。此外，p65缺失显著抑制了由IKKβ表达或TNFα刺激诱导的SLC31A1转录活性的改变， compared to 强制表达IκBα-DN或QNZ给药。

与此一致，在乳腺癌细胞和乳腺癌组织中观察到p65激活（p-p65或核p65）或IκBα磷酸化与CTR1表达的负相关，表明NF-κB通路对CTR1的潜在负调控。接下来，通过缺失IKKβ破坏铜稳态以上调CTR1-铜轴，并观察到IKKβ缺陷细胞对TTM给药更敏感，通过细胞凋亡和凋亡标志物（如 cleaved Caspase-3（cCaspase-3）和 cleaved PARP（cPARP））或集落形成 assays 测量。

因此，这些发现提供了CTR1被TNFα/LPS诱导的NF-κB激活负调控的机制，并揭示了CTR1通过铜-NF-κB通路的负反馈调控。

激活铜-CTR1轴导致靶向NF-κB信号的耐药

尽管针对NF-κB通路的积累抑制剂已被批准用于炎症性疾病，并在临床试验中探索用于癌症治疗，但细胞毒性和免疫相关副作用限制了它们在抗击癌症中的使用。一个可能的原因是CTR1和铜摄取的提升，导致MAPK和AKT通路的激活，从而对NF-κB抑制剂（如QNZ）产生耐药。

因此，推断用铜螯合剂TTM剥夺铜的细胞对QNZ更敏感。为此，将NF-κB抑制剂与铜螯合剂在不同乳腺癌细胞中联合使用，并观察到这种联合治疗强烈增强了治疗效果， compared to 个体治疗，通过减少细胞生长、集落形成和增加细胞凋亡。

而且，TTM和QNZ的联合协同抑制了人乳腺肿瘤生长并促进异种移植小鼠模型中的肿瘤凋亡，而对小鼠体重没有显著影响，伴随MAPK和AKT活性的降低，以及抑制鼠乳腺肿瘤生长而对小鼠体重没有显著影响，伴随PD-L1表达的减少和CD8⁺细胞的增加。

为了进一步探索NF-κB抑制剂与铜螯合剂联合的潜在应用，使用了人乳腺癌类器官，并观察到联合治疗 dramatically 促进了类器官破坏和凋亡，无论是在HER2阳性还是三阴性乳腺癌来源的类器官中。

此外，在MMTV-PyMT乳腺癌症小鼠模型中，QNZ与TTM联合有效减少了乳腺肿瘤生长和肺转移，对小鼠体重和肝或肾组织的毒性有轻微影响，伴随NF-κB活性和MAPK/AKT活性的降低。而且，QNZ和TTM联合协同调节免疫微环境，通过减少PD-L1表达和增加CD8⁺和CD4⁺ T细胞以及颗粒酶B（GZMB）的分泌。这些发现表明，靶向铜-CTR1轴可为协同NF-κB抑制剂治疗乳腺癌提供新策略。

NF-κB抑制剂与铜死亡诱导剂联合用于乳腺癌治疗

由于CTR1在介导elesclomol（ES）诱导的铜死亡中的 potent 作用以及NF-κB激活对CTR1的负调控，试图开发NF-κB抑制剂与ES的潜在策略。为此，缺失了IKKβ，这可阻断NF-κB通路，并观察到阻断NF-κB可使癌细胞对ES处理敏感，伴随DLAT寡聚体的增加和HSP70水平的增加，以及DLAT在线粒体中的聚集，这些是铜死亡的标志。

而且，使用了NF-κB抑制剂QNZ与ES联合的功能，可显著抑制细胞活力和集落形成， coupled with 铜死亡标志物的增加。如此，进行了QNZ与ES联合的体内研究，强烈减少了肿瘤生长并增强了铜死亡， compared to 个体治疗，具有耐受持续时间。这些发现为促进铜死亡治疗乳腺癌提供了替代策略。

讨论

积累的证据表明，微量元素如锰（Mn）、铜（Cu）和铁（Fe）在免疫调节和肿瘤发生中起意想不到的作用。其中，铜已被我们小组和其他人证明发挥致癌作用，特别是通过直接结合MEK、PDK1和ULK激活下游信号通路如ERK、AKT和自噬，从而促进黑色素瘤、乳腺癌和非小细胞肺癌中的肿瘤生长。然而，铜对肿瘤微环境（TME）的影响尚未很好探索。

与先前报道一致，观察到铜-CTR1轴在NF-κB通路的生理或病理激活中起 essential 作用，通过直接结合TAK1促进其K63连锁泛素化，激活IKKβ并增强p65核转位。因此，下游细胞因子如TNFα、IL-6和IL-1β以及免疫检查点PD-L1可在铜积累时被重塑。这可能归因于细胞因子或趋化因子的分泌，这些因子重塑TME以影响肿瘤发生。然而，TAK1的其他下游靶点，包括p38、JNK，是否涉及铜功能，同时，铜积累时AKT/ERK和NF-κB通路之间的串扰，可能为铜-CTR1轴提供更复杂的致癌机制，这需要进一步调查。

除了作为致癌轴，过量铜积累也可通过TCA循环特异性死亡方式诱导细胞死亡，称为铜死亡。因此，细胞铜的数量或平衡将决定细胞命运。调查铜-CTR1负反馈循环将为这种调控提供新线索。尽管先前工作表明了铜对CTR1水平的潜在负调控而没有清晰机制，这里证明了NF-κB可在生理和病理条件下转录负调控CTR1表达。而且，定义了并验证了p65与CTR1启动子区域的直接结合。

鉴于铜-CTR1在正激活NF-κB通路中的潜在作用，显示了NF-κB对CTR1的负调控， thus forming a negative feedback loop on copper regulation of CTR1 to maintain copper uptake balance。此外，铜-CTR1轴提供了NF-κB通路的负反馈循环以维持NF-κB平衡。因此，扰乱铜-NF-κB平衡的信号将异常影响 these two pathways，导致异常炎症和肿瘤发生。因此，可能扰乱铜-NF-κB平衡的TME或基因组的改变需要进一步探索，为炎症相关疾病提供新证据。

靶向治疗已被开发并广泛应用于乳腺癌治疗。作为慢性炎症和肿瘤发生的主要决定因素，TNFα-NF-κB通路也长期被认为是这些疾病治疗的潜在靶点。然而，由于副作用如抑制免疫系统并导致感染，或对癌症治疗的反应较差或获得性耐药，尽管 significant efforts，NF-κB抑制剂的使用受到限制。

在这项研究中，显示了铜对NF-κB通路激活至关重要，允许我们用其螯合剂阻断铜以部分抑制NF-κB信号并减少炎症和肿瘤发生。此外，在NF-κB激活的癌症中，特别是乳腺癌，用其抑制剂抑制NF-κB通路可促进CTR1-铜上调， thus elevating MEK-ERK and PDK1-AKT pathways to form acquired resistance to NF-κB inhibitors。在这种情况下，铜螯合剂的联合将耗尽铜，并反过来抑制ERK和AKT通路以 sensitize NF-κB inhibitors，如在不同亚型乳腺癌细胞、异种移植肿瘤、不同亚型患者类器官和MMTV-PyMT鼠乳腺癌症中验证。

另一方面， instead of chelating copper，随着CTR1提升，铜离子载体如ES的联合已被验证促进铜死亡。在这种条件下，较少剂量的NF-κB抑制剂将与ES协同杀死乳腺癌，作为癌症治疗的替代选项。尽管两种方法 either repressing cuproplasia or inducing cuproptosis 已被提出并验证 here to efficiently combat breast cancer，哪种用于潜在临床应用的选择应通过使用不同亚型患者来源异种移植（PDX）小鼠模型或人源化小鼠模型进一步验证。同时，尽管我们使用了较低剂量的NF-κB抑制剂以减轻副作用，一些细胞毒性也存在于具有耐受的免疫 Competent 小鼠中。

因此，优化NF-κB抑制剂和铜螯合剂/铜死亡诱导剂的治疗窗口以实现更大疗效和更少副作用将为慢性炎症诱导的癌症提供有前景的策略。