柑橘CtrCBL1/CtrCIPK6复合体通过磷酸化CtrBBX32调控CtrSTP1介导的糖积累与耐冷性新机制

本文揭示了柑橘耐冷新机制：CtrCBL1/CtrCIPK6钙信号复合体磷酸化转录抑制因子CtrBBX32，解除其对CtrZAT10和糖转运蛋白基因CtrSTP1的抑制，促进根系糖积累（包括葡萄糖、果糖和蔗糖）并增强冷胁迫耐受性。该研究为植物抗寒育种提供了关键靶点（如CtrSTP1、CtrBBX32、CtrZAT10、CtrCIPK6），深化了钙信号（Ca2+）-CBL-CIPK模块调控糖转运的认识。

　　

引言

低温是制约植物生长发育的关键环境因子，作物生产力和地理分布受其显著影响。作为固着生物，植物通过进化复杂的分子调控网络协调生理和分子适应，包括转录重编程、翻译调整和代谢重塑。冷适应的一个标志是细胞内渗透保护剂的积累，这一策略对于在低温条件下保持膜完整性和减轻细胞脱水至关重要。该过程的关键化合物包括甜菜碱、脯氨酸和可溶性糖。虽然可溶性糖主要在光合源组织（如叶片）中合成，但它们通过源-库转运机制随后分配到库器官，是系统耐冷性的重要组成部分。然而，在冷胁迫期间，库组织（特别是根）中糖转运和利用的分子机制仍不完全清楚。

植物中碳水化合物的空间分布受到不同组织和细胞区室中定位的多种糖转运蛋白的严格调控。植物中已经鉴定出多类膜结合糖转运蛋白，包括最终会被输出的糖转运蛋白（SWEETs）、蔗糖转运蛋白（SUTs）和单糖转运蛋白（MSTs）。这些转运蛋白通过碳源分布或糖介导的信号在植物对生物和非生物胁迫的反应中发挥关键作用。值得注意的是，MST家族中的糖转运蛋白（STPs）主要介导从质外体摄取己糖。目前对STPs的研究主要报道于从土壤中获取根际糖、与病原体竞争质外体糖或病原体可能利用的可溶性糖的输入过程以及糖利用和储存过程。这些多方面的作用强调了STPs在植物系统内平衡养分获取、病原体相互作用动力学和代谢调节中的关键参与。虽然冷胁迫已被证明诱导STP成员的表达，但STP介导的耐冷性的机制基础，特别是它们的调控网络和上游效应子，仍然特征不足。

基因的表达受到多种转录因子（TFs）的精确调控，使生物体能够适应各种环境刺激。在这些调节因子中，ZAT蛋白，作为半胱氨酸-2/组氨酸-2（C2H2）型锌指家族的成员，已被记录参与盐、干旱和冷胁迫反应。类似地，属于B-Box锌指家族的BBX蛋白在植物对非生物胁迫的适应中发挥关键作用。尽管BBX和ZAT家族转录因子在各种环境线索（包括冷胁迫）下的作用逐渐阐明，但需要进一步研究以了解这些因子如何影响植物冷反应及其在冷胁迫下可溶性糖积累中的潜在参与。

在瞬时冷胁迫下，由于从质外体或液泡的Ca²⁺流入，植物细胞表现出细胞溶质Ca²⁺水平的快速升高，随后被钙传感器蛋白识别。一套钙解码蛋白，包括钙调蛋白（CaM）、类钙调蛋白、钙依赖性蛋白激酶和类钙神经素B蛋白（CBLs），已被确定为冷胁迫钙信号反应中的关键组成部分。值得注意的是，CBL/CIPK信号网络在植物对冷胁迫的反应中发挥关键作用。此外，它们参与胁迫条件下的糖转运过程已通过多项研究报道。例如，在苹果（Malus domestica）中，MdCIPK22被显示磷酸化MdSUT2.2，促进糖积累和耐旱性；而在盐胁迫下，MdCIPK13通过磷酸化增强MdSUT2.2的稳定性和转运活性。在棉花（Gossypium hirsutum）中，CBL2–CIPK6–TST2信号级联调节葡萄糖稳态以改善非生物胁迫恢复力。在水稻（Oryza sativa）中，过表达OsCIPK03和OsCIPK12的转基因植物在冷和干旱胁迫下表现出显著高于野生型植物的可溶性糖含量，可能归因于糖转运蛋白基因表达水平的显著升高。然而，CBL/CIPK模块如何在低温信号下特异性调节糖转运的机制理解仍有待阐明。

结果

CtrSTP1是冷诱导的并在根中丰富表达

为了探索糖转运蛋白在冷胁迫下柑橘可溶性糖积累调节中的潜在作用，我们基于先前通过RNA测序从冷处理的枳橙（Citrus trifoliata）植物生成的转录组数据集分析了糖转运蛋白基因的表达模式。一个名为CtrSTP1（Pt2g026610）的STP被发现在冷处理下被显著诱导。RT-qPCR还显示，在冷条件（4°C）下，CtrSTP1的转录水平在根中于24小时开始增加，然后从72小时急剧上升到240小时的最高水平，而在正常温度（25°C）下mRNA丰度保持低且稳定。此外，CtrSTP1在根中显著表达，相对于叶和茎，这通过RT-qPCR得到证实。原位杂交试验显示，CtrSTP1主要在根的皮层薄壁细胞中表达。使用烟草原生质体的亚细胞定位分析表明，当使用对照载体（35S:YFP）时，黄色荧光蛋白（YFP）信号分布在细胞质和细胞核中。相比之下，当转化35S:CtrSTP1-YFP载体时，YFP信号仅观察到在质膜上，与膜标记精确重叠。这些结果表明CtrSTP1是一个质膜定位的蛋白。鉴于CtrSTP1表达在冷条件下上调并主要在根中表达，我们测量了暴露于冷处理的枳橙根中可溶性糖（包括果糖、葡萄糖和蔗糖）的含量。结果表明，在冷处理存在下，根中的可溶性糖逐渐增加，这与CtrSTP1的表达水平正相关，暗示CtrSTP1在冷胁迫下介导根中可溶性糖积累的潜在作用。

使用糖转运蛋白缺陷型酵母菌株CSY4000检查了CtrSTP1的糖转运特性，该菌株不能摄取己糖或蔗糖。为此，将用融合构建体pDR196-CtrSTP1或空载体pDR196（用作阴性对照）转化的CSY4000铺板在添加不同糖的合成缺失（SD）/ -Ura（U）培养基上。酵母细胞在含有麦芽糖的培养基上生长良好，但在添加蔗糖的培养基上不生长。相比之下，用pDR196-CtrSTP1转化的酵母细胞可以在添加葡萄糖或果糖作为唯一碳源的培养基上正常生长，而阴性对照的生长被抑制，这意味着CtrSTP1可以摄取葡萄糖和果糖。为了进一步确定CtrSTP1的动力学参数，我们使用¹⁴C-葡萄糖（¹⁴C-Glc）进行了糖摄取试验。正如预期，用pDR196-CtrSTP1转化的酵母细胞吸收了¹⁴C-Glc，而阴性对照没有摄取。此外，当它们在pH为5的培养基中培养时，检测到用pDR196-CtrSTP1转化的酵母细胞的¹⁴C-Glc最高转运速率。然后我们通过测量存在十倍过量非放射性糖的情况下¹⁴C-Glc的转运速率来确定CtrSTP1的底物特异性。添加己糖（包括葡萄糖、果糖和甘露糖）显著降低了¹⁴C-Glc的摄取速率，但戊糖（核糖）或其他寡糖（蔗糖、棉子糖、水苏糖）没有，表明CtrSTP1使用己糖作为其特异性底物。此外，质子解偶联剂羰基氰化物间氯苯腙（CCCP）显著抑制了用pDR196-CtrSTP1转化的酵母细胞对¹⁴C-Glc的摄取，表明CtrSTP1介导的己糖摄取需要质子梯度。根据在不同浓度下提供的¹⁴C-Glc的摄取，CtrSTP1对葡萄糖的K_m为100.63 ± 23.92 μM，最大摄取速率（V_max）在pH 5.0下为6.85 ± 1.22 pmol mg^?1 min^?1细胞。总之，这些结果表明CtrSTP1是一个冷诱导的定位于质膜的己糖转运蛋白。

CtrSTP1通过影响可溶性糖含量在耐冷性中发挥作用

由于CtrSTP1被冷胁迫诱导，我们努力研究CtrSTP1在耐冷性中的生物学功能。为此，采用烟草脆裂病毒（TRV）为基础的病毒诱导基因沉默（VIGS）方法在枳橙中敲低CtrSTP1。在正常生长条件下，VIGS植物相对于TRV-EV（空载体）对照没有观察到形态学变异。当暴露于冷处理（-6°C 6小时）时，VIGS系表现出比TRV-EV对照更快和更明显的植物损伤，如严重的叶片卷曲和枯萎所证明。与植物表型一致，VIGS植物在冷处理下显示出显著减弱的叶绿素荧光、更高的电解质泄漏（EL）和丙二醛（MDA）水平、更大的活性氧（ROS）积累，包括H₂O₂和O₂^•?，相对于TRV-EV对照。此外，VIGS植物根中的可溶性糖含量，包括己糖（果糖和葡萄糖）和蔗糖，显著低于TRV-EV对照。为了澄清蔗糖含量的变化，我们进一步分析了蔗糖磷酸合酶（SPS）基因（CtrSPS1/CtrSPS2/CtrSPS3/CtrSPS4）的转录水平，这些是调节蔗糖合成的关键限速酶。VIGS系中CtrSPS2/CtrSPS3/CtrSPS4的表达低于TRV-EV对照，意味着较低的果糖和葡萄糖含量导致CtrSPS2/CtrSPS3/CtrSPS4表达水平降低，进而导致合成蔗糖减少。还测量了VIGS系和TRV-EV对照的光合速率，显示光合速率没有显著差异，表明VIGS系中糖含量的减少是由糖转运和代谢引起的。

接下来，利用农杆菌介导的遗传转化产生过表达CtrSTP1基因的转基因柠檬（Citrus × limon）植物，这是一种已知对冷敏感的柑橘物种。选择两个独立的转基因系（#1和#2）用于后续耐冷性评估。在暴露于冷冻条件（-2°C 4小时）后，对照植物（OE-EV）表现出严重的叶片干燥和萎蔫，而过表达CtrSTP1的转基因系（OE-CtrSTP1）保持活力，叶片损伤最小。在标准生长条件下，OE-CtrSTP1和OE-EV植物之间在叶绿素荧光参数、EL、MDA含量或根脱氢酶活性方面没有观察到显著差异。然而，在冷胁迫条件下，OE系表现出显著增强的叶绿素荧光、减少的EL和MDA积累、更高的根脱氢酶活性以及叶片和根中更低的ROS积累，与对照植物相比。此外，OE-CtrSTP1系叶片和根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量显著高于OE-EV对照。这些发现共同证明CtrSTP1过表达促进可溶性糖积累并赋予柠檬植物改进的冷胁迫耐受性。

为了进一步探索CtrSTP1在根中的功能，我们通过发根农杆菌介导的转化枳橙枝条生成了过表达CtrSTP1（OE-CtrSTP1）的发根，使用含有与绿色荧光蛋白（GFP）基因框内融合的CtrSTP1的载体，使用表达空载体的发根作为阴性对照（OE-EV）。在所有阳性发根中检测到GFP信号，但在枝条中 absent。RT-qPCR显示OE-CtrSTP1系中CtrSTP1的表达水平显著高于OE-EV。当 subjected to the cold treatment (-6°C for 12小时)，OE-EV受损程度更严重，表现为严重的叶片卷曲和枯萎、显著受损的叶绿素荧光、显著更高的EL和MDA水平、更低的根脱氢酶活性以及根中更大的ROS积累，与OE-CtrSTP1植物相比。此外，OE-CtrSTP1系根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量以及根中CtrSPS2/CtrSPS3/CtrSPS4的转录水平显著高于OE-EV对照。总之，这些结果表明CtrSTP1过表达通过促进根中可溶性糖积累赋予增强的耐冷性。

CtrBBX32抑制而CtrZAT10激活CtrSTP1转录

为了理解CtrSTP1的分子调控，使用CtrSTP1的启动子（pCtrSTP1）作为诱饵，对来自枳橙幼苗的DNA文库进行了酵母单杂交（Y1H）筛选。总共对70个阳性克隆进行了测序，其中Pt7g004290.1和Pt8g003020.1分别注释为B-box锌指蛋白32-like（CtrBBX32）和C2H2型锌指蛋白（CtrZAT10）。CtrBBX32和CtrZAT10在根中表现出相对较高的转录水平，相对于其他组织。在冷胁迫下，两个基因在根中的表达水平被诱导，CtrBBX32表现出快速诱导随后在长时间暴露下下降，而CtrZAT10显示较慢的初始诱导并随着延长冷处理逐渐增加表达。亚细胞定位试验表明，CtrBBX32和CtrZAT10都被确认定位于细胞核。此外，转录激活分析表明CtrZAT10在其C末端蛋白区域内显示出正常的转录激活活性，而CtrBBX32在酵母系统中没有转录激活活性。

然后我们使用不同的方法评估CtrZAT10和CtrBBX32与pSTP1的相互作用。1-kb的pCtrSTP1序列包含一个CTGTAACAGTA motif和一个G-box（GACGTG），分别被CtrZAT10和CtrBBX32蛋白识别。首先，我们使用全长pCtrSTP1或两个含有G-box元件或CTGTAACAGTA motif的部分片段构建了诱饵载体，以及GAL4AD-CtrBBX32/CtrZAT10构建体作为猎物。Y1H显示，用CtrBBX32的猎物和含有G-box的诱饵转染的酵母细胞，或用CtrZAT10的猎物和含有CTGTAACAGTA核心序列的诱饵转染的酵母细胞，在添加aureobasidin A（AbA）的合成缺失培养基上生长良好，意味着CtrBBX32和CtrZAT10分别通过两个顺式作用元件与pCtrSTP1相互作用。为了评估CtrBBX32和CtrZAT10是否直接和特异性地与pCtrSTP1中它们的识别元件相互作用，我们使用重组谷胱甘肽S-转移酶（GST）-CtrBBX32和GST-CtrZAT10蛋白以及生物素标记的含有G-box序列或CTGTAACAGTA的40-bp DNA探针进行了电泳迁移率变动分析（EMSA）。当GST-CtrBBX32与含有G-box元件的探针孵育或当GST-CtrZAT10与含有CTGTAACAGTA motif的探针孵育时，观察到一个强烈的变动条带。通过添加未标记的竞争者，条带变动以剂量依赖性方式减少，而当重组蛋白与含有突变顺式作用元件的探针孵育时，凝胶变动完全消除。这些结果表明CtrBBX32和CtrZAT10通过直接和特异性地结合它们的识别motif与pCtrSTP1相互作用。为了进一步评估体内两个TFs和pCtrSTP1之间的相互作用，我们将35S:FLAG（用作对照）、35S:CtrBBX32-FLAG或35S:CtrZAT10-FLAG的构建体引入柑橘愈伤组织。然后使用特异性引物进行染色质免疫沉淀（ChIP）试验结合定量PCR（ChIP-qPCR）。结果，我们发现CtrBBX32和CtrZAT10分别在含有G-box motif或CTGTAACAGTA序列的启动子区域显著富集，这支持了两个TFs和pCtrSTP1之间的特异性相互作用。为了检查CtrBBX32和CtrZAT10的转录激活能力，我们在本氏烟草叶片中进行了双荧光素酶（LUC）瞬时试验，使用35S:CtrBBX32和35S:CtrZAT10作为效应子， together with the pCtrSTP1:LUC作为报告子。荧光可视化都表明启动子活性被35S:CtrBBX32显著降低，但被35S:CtrZAT10显著增加，与对照相比。总之，我们的数据揭示了CtrBBX32和CtrZAT10都直接靶向CtrSTP1启动子，其中CtrBBX32介导转录抑制而CtrZAT10激活表达。

CtrBBX32结合CtrZAT10的启动子并抑制其表达

为了更深入探究CtrBBX32和CtrZAT10之间的调控关系，我们进行了点对点验证它们之间的物理相互作用和调控关系。酵母双杂交试验结果初步表明CtrBBX32和CtrZAT10彼此不物理相互作用。此外，双分子荧光互补（BiFC）试验也证明两个蛋白之间没有检测到相互作用。基于启动子序列分析，使用Y1H和双LUC瞬时试验的蛋白-DNA相互作用验证，我们发现CtrZAT10不结合CtrBBX32的启动子。然而，在CtrZAT10的启动子（pCtrZAT10）中鉴定出两个G-box顺式作用元件。Y1H证明CtrBBX32结合到两个pCtrZAT10片段中的一个。此外，EMSA显示CtrBBX32直接和特异性地结合到含有G-box序列的启动子片段。ChIP-qPCR试验表明CtrBBX32在含有G-box元件的启动子区域显著富集，进一步验证了体内相互作用。双LUC试验显示转染CtrBBX32效应子和pCtrZAT10:LUC报告子导致启动子活性显著抑制。总之，这些结果表明CtrBBX32通过相互作用于pCtrZAT10中的G-box作为CtrZAT10的转录抑制子。

CtrBBX32负调控枳橙的耐冷性

为了探索CtrBBX32在耐冷性中的生物学功能，我们使用VIGS在枳橙中敲低CtrBBX32。在正常生长条件下，沉默植物和TRV-EV对照在形态上彼此相似。通过暴露6周龄幼苗于冷处理（-6°C 6小时）进行表型评估。我们观察到TRV-EV植物表现出更快的植物损伤和 drastically decreased cold tolerance relative to the VIGS plants; these phenotypic differences were evidenced by serious leaf curling and necrosis, weakened chlorophyll fluorescence, higher levels of EL, MDA, and ROS in the presence of cold stress. 鉴于CtrBBX32抑制CtrSTP1和CtrZAT10的表达，分析了可溶性糖含量以及CtrSTP1和CtrZAT10的表达水平。结果表明，CtrBBX32-VIGS系中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，以及CtrSTP1和CtrZAT10的mRNA丰度，显著高于TRV-EV对照。为了进一步阐明CtrBBX32在耐冷性中的作用，我们通过发根农杆菌介导的转化产生了过表达CtrBBX32的枳橙发根。通过检查GFP表达确认具有阳性发根的植物（OE-EV, OE-CtrBBX32）进行冷处理（-6°C 6小时）。OE-CtrBBX32系与OE-EV植物相比受损程度更大，如明显的植物死亡和崩溃的叶绿素荧光所指示。此外，显著更高的EL、MDA和ROS，但更低的根脱氢酶活性，在OE-CtrBBX32系中注意到相对于OE-EV对应物。此外，OE-CtrBBX32系根中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量， together with the transcript levels of CtrSTP1 and CtrZAT10, were significantly decreased in comparison with the OE-EV lines. Taken together, these results show that CtrBBX32 functions as a negative regulator of cold tolerance by downregulating the expression of CtrSTP1 and CtrZAT10 and inhibiting the soluble sugar accumulation in the roots.

CtrZAT10在耐冷性中发挥积极作用

为了说明CtrZAT10在耐冷性中的生物学作用，我们首先使用VIGS沉默枳橙中的CtrZAT10。TRV-EV对照和CtrZAT10-VIGS植物在正常条件下都生长良好。然而，当6周龄植物 subjected to cold treatment (-6°C for 6小时, recovery for 12小时 at ambient temperature)，VIGS植物 demonstrated prominently decreased cold tolerance compared with the TRV-EV control, as manifested by quicker and more serious leaf curling and withering and weaker chlorophyll fluorescence. 与植物表型一致， higher EL and greater accumulation of MDA and ROS were scored in the VIGS lines relative to the TRV-EV control in the presence of cold treatment. 此外，CtrZAT10-VIGS系中的可溶性糖含量，包括果糖、葡萄糖和蔗糖，显著低于TRV-EV对照。CtrSTP1的转录水平在CtrZAT10 VIGS系中 dramatically downregulated, while the CtrBBX32 expression level underwent minor changes. 同样，我们 employ the Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation system to generate hairy roots overexpressing 35S:CtrZAT10-GFP (OE-CtrZAT10) or 35S:GFP (OE-EV) in trifoliate orange plants. Upon exposure to cold treatment (-4°C for 4小时), the OE-CtrZAT10 lines exhibited dramatically increased cold tolerance in comparison with the OE-EV plants, as indicated by better plant growth and stronger chlorophyll fluorescence, lower EL and MDA levels, less ROS in the roots, but higher root dehydrogenase activity. Meanwhile, the contents of glucose and sucrose, together with the expression level of CtrSTP1, were significantly elevated in the roots of OE-CtrZAT10 plants in comparison with OE-EV, whereas no change in the fructose content was observed. Taken together, these findings suggest that CtrZAT10 positively regulates cold tolerance of trifoliate orange by upregulating CtrSTP1 and increasing the contents of soluble sugars.

CtrCIPK6与CtrBBX32相互作用并磷酸化它

使用特异性抗体检测了枳橙根中的CtrBBX32蛋白水平。值得注意的是，CtrBBX32蛋白在环境条件下保持稳定，但在暴露于4°C冷处理后表现出逐渐减少，表明冷胁迫可能 destabilize CtrBBX32 in trifoliate orange. 以前有报道称BBX蛋白的稳定性在翻译后水平被修饰。因此推测CtrBBX32可能被一些参与翻译后修饰途径的蛋白降解。为了探索可能调节冷胁迫存在下CtrBBX32稳定性的因素，我们使用pGBKT7-CtrBBX32作为猎物通过酵母双杂交（Y2H）系统筛选来自枳橙幼苗的cDNA文库以鉴定CtrBBX32的潜在相互作用蛋白。总共获得73个阳性克隆并测序。在候选者中，一个注释为CBL相互作用蛋白激酶6（CtrCIPK6）的蛋白引起了我们的注意，因为CIPK是钙信号途径中的一个关键因子，已被显示在冷胁迫反应调节中发挥关键作用。此外，表达模式分析证明CtrCIPK6在低温条件下上调并在根中显示相对较高的表达，并且基于YFP信号的CtrCIPK6蛋白定位于细胞核和细胞质，表明其在冷胁迫期间与CtrBBX32相互作用的潜在参与。我们然后通过不同方法验证了CtrCIPK6和CtrBBX32之间的相互作用。点对点Y2H试验使用共表达 both BD-CtrBBX32 and AD-CtrCIPK6的酵母细胞可以在选择培养基上生长，表明CtrCIPK6与CtrBBX32相互作用。BiFC结果证明CtrCIPK6在细胞核中与CtrBBX32相互作用，而CtrBBX32和CtrCIPK9的其他CIPK成员之间没有观察到相互作用。荧光素酶互补成像（LCI）显示共表达nLUC-CtrBBX32和cLUC-CtrCIPK6，其中CtrBBX32和CtrCIPK6分别融合到LUC报告子的N端半部和C端半部，在本氏烟草叶片中重建了功能性LUC，证实了体内CtrCIPK6和CtrBBX32之间相互作用的存在。在 pull-down试验中，His-CtrCIPK6蛋白可以被GST-CtrBBX32拉下和富集，但不能被GST alone，这进一步证实了CtrCIPK6和CtrBBX32之间的体外相互作用。此外，共免疫沉淀（Co-IP）试验表明在本氏烟草叶片中CtrCIPK6-MYC与CtrBBX32-GFP的共检测，但不与GFP alone，意味着CtrCIPK6和CtrBBX32在植物中的相互作用。总之，这些结果 corroborated the notion that CtrCIPK6 physically interacted with CtrBBX32 in plants. 另一方面， both Y2H and BiFC assays revealed that no point-to-point interaction was observed between CtrCIPK6 and CtrZAT10.

鉴于CtrBBX32与蛋白激酶CtrCIPK6相互作用，我们假设CtrBBX32可能作为CtrCIPK6的潜在底物并被CtrCIPK6磷酸化。为了确认这个假设，我们进行了体外磷酸化试验使用磷酸丝氨酸/苏氨酸抗体，显示重组GST-CtrCIPK6蛋白磷酸化了GST-CtrBBX32。为了确定CtrBBX32上由CtrCIPK6靶向的潜在磷酸化位点，我们孵育了重组GST-CtrBBX32和GST-CtrCIPK6，然后进行液相色谱-串联质谱分析。结果，CtrBBX32蛋白的丝氨酸（Ser）-108被鉴定为由CtrCIPK6靶向的推定磷酸化位点。当Ser 108突变为丙氨酸（BBX32^S108A），一个不可磷酸化的形式，CtrCIPK6对CtrBBX32的磷酸化强度与野生型Ctr