钙稳态调节蛋白Calhm6通过Chp1-Camk4-Creb1轴及胞外囊泡递送调控巨噬细胞极化与炎症反应的新机制

本研究发现离子通道Calhm6通过胞外体（ectosome）递送抑制LPS诱导的重度炎症，并揭示其通过支架蛋白Chp1介导CaMK4磷酸化，形成Calhm6-Chp1-CaMK4膜复合物，以钙依赖方式激活Creb1促进M2样巨噬细胞极化。相反，Calhm6缺失会增强Irf1介导的M1样极化及杀菌活性。该研究为炎症性疾病治疗提供了新型靶点（如CALHM6、CHP1、CAMK4、CREB1、IRF1、STAT6等）。

　　

引言：巨噬细胞极化的调控机制与离子通道的作用

巨噬细胞作为免疫系统的前线防御细胞，具有可塑性，能极化为促炎的M1样表型或抗炎的M2样表型，分别参与炎症防御和组织修复。离子通道在免疫细胞调节中至关重要，但其在巨噬细胞极化中的具体机制尚不明确。CALHM6（FAM26F）属于钙稳态调节蛋白家族，是一种大孔离子通道，在溃疡性结肠炎和感染性疾病中表达异常，但其免疫功能仍待深入探索。

Calhm6胞外体抑制LPS诱导的重度炎症

研究通过向野生型小鼠注射LPS，分离血清中的胞外体（ectosome）和外泌体（exosome），发现注射24小时时间点的胞外体能显著提高LPS处理小鼠的存活率，降低血清IL-6和TNFα水平，并减轻肺损伤。质谱分析显示，Calhm6在LPS刺激后显著诱导并包裹在胞外体中。Calhm6敲除小鼠来源的胞外体无法抑制促炎细胞因子产生。Calhm6在脾脏、骨髓和外周血单核细胞（PBMCs）中高表达，尤其在巨噬细胞中富集。过表达Calhm6的RAW 264.7细胞（OE-Calhm6）分泌的胞外体能被巨噬细胞内化，并恢复Calhm6敲除骨髓来源巨噬细胞（BMDMs）的Calhm6表达。体内实验表明，注射OE-Calhm6来源的胞外体-Calhm6能改善LPS挑战小鼠的存活率、减轻肺损伤和降低促炎细胞因子水平。临床样本分析显示，细菌性肺炎患者CD11b⁺巨噬细胞中CALHM6、IFNG、TNFA和IL-12 mRNA水平显著升高，且Calhm6表达与这些细胞因子正相关。小鼠BMDMs在Escherichia coli、Staphylococcus aureus、Candida albicans或LPS刺激后，Calhm6表达显著上调，而其他CALHM家族成员（Calhm1–5）对炎症刺激反应微弱。

胞外体-Calhm6通过M2样巨噬细胞极化缓解炎症并促进组织修复

野生型小鼠来源的胞外体能显著增加BMDMs中M2样标志物（如ARG1和IL-10）的表达，而Calhm6敲除来源的胞外体无此效应。OE-Calhm6细胞来源的胞外体强烈上调巨噬细胞M2样标志物，并抑制LPS或脂磷壁酸（LTA）激活的NF-κB和MAPK信号通路。OE-Calhm6细胞呈现纺锤形M2样形态，且在钙存在时高表达M2样因子。LPS刺激诱导OE-Calhm6细胞更高的钙内流。LPS/IFNγ处理能有效包裹Calhm6到胞外体中，并增强Calhm6与胞外体生物发生标志物TSG101的共定位。在小鼠切除性伤口夹板模型中，胞外体-Calhm6注射显著改善伤口愈合，促进CD206阳性巨噬细胞浸润，并增加皮肤伤口中ARG1和TGF-β1表达。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎模型中，胞外体-Calhm6处理的小鼠表现出改善的疾病活动指数（DAI）、减少的结肠上皮脱落和炎症细胞浸润。在对乙酰氨基酚（APAP）诱导的肝损伤模型中，N-乙酰半胱氨酸（NAC）与胞外体-Calhm6联合使用有效防止肝脏中心小叶坏死病变的扩展。

Calhm6缺失通过Creb1失活增强M1样巨噬细胞极化

Calhm6敲低的Raw264.7细胞（sh-Calhm6）抵抗IL-4诱导的M2样极化，但自发表达升高的M1样标志物，且LPS/IFNγ处理进一步放大这些标志物的表达。Calhm6缺陷巨噬细胞在LPS/IFNγ刺激下呈现“煎蛋”形态 with 伪足延伸，而IL-4无法诱导M2样纺锤形态。转录组分析显示，Calhm6缺失在M1和M2样极化条件下均增加促炎基因表达并减少抗炎基因表达。Calhm6敲除BMDMs显示升高的细胞外酸化率（ECAR）和降低的氧消耗率（OCR），表明代谢向M1样糖酵解代谢转变。流式细胞术分析显示，Calhm6敲除小鼠脾脏和淋巴结中F4/80⁺ CD11b⁺细胞中CD86⁺巨噬细胞（M1样）比例更高，而CD206⁺巨噬细胞（M2样）比例显著降低。Calhm6敲除不影响胸腺、脾脏和淋巴结中T和B细胞的发育和激活。Calhm6敲除BMDMs在LPS/IFNγ或IL-4刺激下显示Creb1激活显著减少。Calhm6缺陷损害CaCl₂和IL-4诱导的Creb1核定位。药理学抑制Creb1（使用KG-501和666-15）有效抑制OE-Calhm6细胞中Creb1激活和M2样极化。LPS诱导的钙内流在Calhm6敲除BMDMs中显著降低。降低钙浓度抑制OE-Calhm6细胞中Creb1磷酸化。Creb1是M2样巨噬细胞极化的关键转录因子，其失活导致巨噬细胞倾向于促炎表型。

Calhm6缺陷小鼠显示增强的杀菌活性但严重的炎症反应

在盲肠结扎穿刺（CLP）模型中，Calhm6敲除小鼠显示更高的存活率和显著减少的病理肺损伤，血清炎症因子水平显著降低，组织中细菌负荷减少。相反，腹腔注射胞外体-Calhm6增加野生型小鼠的死亡率和各种组织中的病原负荷。在LPS挑战模型中，Calhm6敲除小鼠显示较低的存活率和更严重的肺损伤，血清促炎细胞因子水平显著升高。Calhm6敲除BMDMs在LPS刺激后表达显著更高水平的IL-6、TNFα和IL-1β。Calhm6敲除BMDMs显示增强的杀菌活性，表现为增加的吞噬作用和活性氧（ROS）产生。相反，OE-Calhm6细胞显示减少的吞噬和杀菌活性。细胞骨架重塑对巨噬细胞吞噬病原体至关重要，Calhm6敲除BMDMs显示显著的丝状伪足形成 with 紧密束状的肌动蛋白和微管蛋白 filaments。Rac1与GFP标记的E. coli共定位在Calhm6敲除BMDMs中显著增强。

Calhm6作为巨噬细胞中的钙渗透性离子通道

过表达Calhm6的巨噬细胞（Raw264.7^OE-Calhm6和THP1^OE-Calhm6）显示略微升高的细胞内钙水平，但这些水平不与Calhm6表达直接相关。Glu119是Calhm6钙选择性和渗透性的关键残基，其突变（E119R）废除Calhm6离子电流。过表达Calhm6^E119R的巨噬细胞未显示细胞内钙显著增加，且无法呈现M2样表型。LPS刺激促进Calhm6向细胞表面转运。糖基化，尤其是O-GlcNAcylation，对膜蛋白运输到质膜至关重要，LPS显著增强Calhm6糖基化。E3泛素连接酶RNF115通过泛素化RAB1A和RAB13抑制ER后运输，RNF115敲低增加Calhm6糖基化和膜定位。质膜定位的Calhm6介导自发钙泄漏。钙成像确认Calhm6过表达RAW264.7细胞在LPS刺激后检测到可测量的钙内流。使用特定抑制剂（HC-067047用于TRP，BTP2用于SOCE，Xestospongin C用于IP₃R，Dantrolene用于RyR）发现，抑制TRP、IP₃R或RyR不改变LPS诱导的反应，而BTP2适度减少它们，表明SOCE有次要贡献。Calhm6过表达巨噬细胞在SOCE阻断后维持强大的LPS诱导内流。瞬时转染Calhm6到Raw264.7细胞（Raw-TrCalhm6）记录全细胞电流，LPS显著增强Raw-TrCalhm6中的离子电流 compared to 未处理对照。观察到的反转电位 near +10 mV 表明Calhm6作为非选择性阳离子通道。逐步增加细胞外Ba²⁺浓度诱导反转电位的逐步正移， consistent with Calhm6对二价阳离子（包括Ca²⁺）的渗透性。钙去除/再添加实验显示，钙再添加在Calhm6细胞中引发强劲内流，但E119R突变体无此效应。在LPS诱导的脓毒症模型中，富含野生型Calhm6的胞外体（Ecto-Calhm6^WT）改善存活率，减少肺病理，抑制全身IL-6/TNF-α/IL-1β水平，并降低器官损伤标志物（包括肌酐（CRE）、血尿素氮（BUN）、丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST））。体外，只有Ecto-Calhm6^WT促进M2极化。HiS-SIM显示Calhm1/2在N2a细胞中显著表面定位，而Calhm6主要细胞质分布。流式细胞术和表面生物素化确认Calhm1/2在表面 fraction，而Calhm6缺失。

Calhm6通过Chp1-Camk4轴促进Creb1激活导致M2样巨噬细胞极化

免疫沉淀和质谱分析显示，IL-4或CaCl₂促进Calhm6与两个重要钙结合蛋白Chp1和CaMK4的相互作用。Chp1敲低Raw264.7细胞（sh-Chp1）呈现促炎M1样表型，并显示LPS或LTA刺激后p38、NF-κB和IκBα磷酸化升高。Chp1敲低导致Raw264.7细胞中OCR减少和ECAR升高。Creb1激活在sh-Chp1细胞中显著减少。过表达Chp1在Raw264.7细胞中促进其向M2表极化和增加Creb1磷酸化。CaMK4作为Creb1磷酸化的上游激酶。Chp1和CaMK4在静息和CaCl₂刺激条件下在细胞膜共定位，这种相互作用在无钙培养基或BAPTA-AM处理下被抑制。CaMK4的激酶域（残基1–296）和Chp1的EF-hand 2域（残基62–106）是它们相互作用所必需的。质谱和定点诱变显示，CaMK4在Ser99磷酸化Chp1，该位点在物种间高度保守。Chp1的Ser99突变（Chp1^S99A）显著破坏其与CaMK4的相互作用。IL-4在钙存在下促进CaMK4磷酸化，而LPS/IFNγ无此效应。

Chp1和CaMK4在M2样极化期间与Calhm6在巨噬细胞膜上组装

Chp1和CaMK4直接结合Calhm6，Chp1显示更强的结合亲和力。IL-4或CaCl₂处理促进CaMK4、Chp1和Calhm6在巨噬细胞膜上的组装。膜-细胞质分离实验和共聚焦显微镜确认Calhm6-Chp1-CaMK4复合物的膜定位。Chp1的存在增加CaMK4与Calhm6的亲和力。Chp1^S99A显著减少与Calhm6的相互作用并破坏Calhm6-Chp1-CaMK4异源三聚体的组装。IL-4处理强劲增加Calhm6和钙存在下CaMK4磷酸化。免疫沉淀分析显示，删除Calhm6或钙螯合剂BAPTA-AM处理能破坏Chp1与复合物的相互作用。共免疫沉淀实验显示，Chp1和CaMK4共表达增强Calhm6单体之间的亲和力。Chp1的EF-hand 1域（残基1–61）与Calhm6的EF-Hand/S4域（残基129–203）相互作用，而CaMK4的激酶域与Calhm6的CHD域（残基204–315）结合。

Irf1和Stat6在巨噬细胞极化期间反向调节Calhm6表达

RNA-seq数据的热图分析显示，Calhm6在E. coli、S. aureus、C. albicans或LPS刺激的巨噬细胞中在离子通道中表达最高。Calhm6 mRNA水平在LPS/INFγ诱导后增加，在12小时更换无LPS/INFγ培养基后显著减少，并在24小时再次LPS/INFγ再挑战后逐渐上升。相反，IL-4下调Calhm6表达，在12小时应用无IL-4培养基后逆转，并在随后IL-4刺激后减少。荧光素酶报告实验确定Irf1是显著促进Calhm6转录和表达的主要转录因子。截断分析识别Irf1结合位点在Calhm6启动子的1 kb区域（–1000 to +1）内。在该区域内，识别三个Irf1结合 motif（(G/A)AA(N3)AAA）。Calhm6 1-kb启动子的荧光素酶报告实验， with or without Irf1结合位点突变，显示–127 to –118 bp之间的结合位点对Calhm6转录关键。链霉亲和素沉淀实验确认Irf1直接结合野生型1-kb Calhm6启动子，对突变启动子亲和力减少。质谱分析显示，LPS/IFNγ处理后，转录因子如AP-1亚基c-Fos（c-FOS）、Irf1、Irf3和Stat1对野生型启动子亲和力增加，但对突变启动子结合减少。IL-4抑制Calhm6表达，Stat6作为关键抑制剂，显著减少Irf1诱导的Calhm6启动子活性。识别Calhm6启动子内四个潜在Stat6结合位点。删除–46 to –37区域显著废除Stat6介导的抑制。进一步链霉亲和素下拉和质谱实验证明，删除该区域减少Stat6对启动子的亲和力并削弱其与Irf1的竞争结合。染色质免疫沉淀（ChIP）实验确认，Irf1结合BMDM细胞中Calhm6启动子，但这种结合被IL-4阻断。有趣的是，用AS1517499抑制Stat6恢复Irf1对启动子的结合。

结论与讨论

本研究阐明CALHM6在促进M2样巨噬细胞极化和维持免疫稳态中的关键作用。机制上，LPS/IFNγ刺激通过IRF1触发巨噬细胞上调CALHM6转录，导致CALHM6在胞外体中增强分泌，这些胞外被邻近巨噬细胞内化。此外，在升高钙水平或IL4刺激条件下，CALHM6、CHP1和CAMK4在细胞膜上组装，通过CHP1-CAMK4启动信号级联，促进Creb1磷酸化并驱动巨噬细胞向M2样表型极化。此外，IL4增强STAT6与CALHM6启动子的结合亲和力，同时抑制IRF1介导的CALHM6转录激活。这些发现集体突出巨噬细胞可塑性和免疫平衡的复杂调控机制。Calhm6作为钙渗透通道，介导巨噬细胞中的钙内流，这对下游信号通路（包括Chp1-CaMK4-Creb1轴）的激活至关重要。这种钙依赖机制驱动M2样巨噬细胞极化，促进抗炎反应和组织修复。相反，Calhm6缺陷使巨噬细胞转向M1样表型，增强杀菌活性但加剧炎症反应。Calhm6被分泌到胞外体中的能力进一步突出其独特功能特征。胞外体-Calhm6作为细胞间通讯的载体，将其抗炎效应转移给受体细胞。该机制不仅放大Calhm6的调控 impact，而且为靶向治疗递送提供潜在策略。