模型引导的系统代谢工程显著提升多刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成效率

本研究通过构建多刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）NHF132的全基因组尺度代谢模型（GEM），系统性解析了多杀菌素（spinosad）生物合成的复杂代谢网络，并据此指导了包括鼠李糖前体（TDP-L-rhamnose）强化、生物合成基因簇（BGC）扩增、短链酰基辅酶A（acyl-CoA）供应优化及底盘重构在内的多维度代谢工程策略。最终工程菌株产量提升553.3%，达1816.8 mg·L?1，为放线菌复杂次级代谢产物的高效合成提供了新范式。

　　

Spn-GEM构建与多杀菌素生物合成分析

放线菌具有复杂的代谢网络，是天然产物（NPs）的重要来源。次级代谢产物的合成与初级代谢密切相关。本研究基于基因组注释，将多杀菌素生物合成模块（包括苷元、弗洛糖胺、伪苷元及spinosyn A的合成）整合至天蓝色链霉菌（S. coelicolor）的经典 Sco-GEM 中，构建了多刺糖多孢菌NHF132的初步Spn-GEM。通过基于强制目标通量修正的流量扫描分析（FSEOF），在葡萄糖作为碳源、理论最大生物量20%至80%作为逐步约束的条件下进行多次模拟，识别出36个上调靶点和20个下调靶点。基于Spn-GEM，多杀菌素生物合成的主要潜在瓶颈被归结为：1）多杀菌素生物合成模块的表达；2）鼠李糖的生物合成；3）短链酰基辅酶A的供应。

多刺糖多孢菌中鼠李糖生物合成途径的过表达

鼠李糖是多杀菌素的关键组分，其生物合成基因的表达直接关系到产量。引入额外拷贝的gtt和epi基因并在强启动子kasop*控制下，可增强鼠李糖的可利用性。本研究构建了包含gtt, epi, gdh, kre以及直接参与多杀菌素合成的spnG, H, I, K基因的过表达质粒pRham-GHIK。通过双亲接合转移成功获得鼠李糖过表达菌株NHF132-Rham-GHIK。发酵实验表明，多杀菌素效价从265.8 mg·L^?1提升至363.7 mg·L^?1，增幅达36.9%。qPCR分析显示，鼠李糖合成相关基因的表达水平提升了51.5至629.7倍。

多刺糖多孢菌中完整多杀菌素BGC的倍增

扩增BGC是提高天然产物产量的相对简单有效的策略。本研究在前期工作基础上，获得了完整的81 kb BAC表达载体pBAC-Spn。通过双亲接合转移成功获得BGC倍增菌株NHF132-BAC-Spn。将完整的74 kb spn-BGC倍增后，多杀菌素效价从279.2 mg·L^?1提升至373.0 mg·L^?1，增幅为33.6%。qPCR分析也显示BGC中包含的基因表达水平提升了1.6至58.5倍。

在多刺糖多孢菌中引入额外的ddTAG途径以切换代谢流

在放线菌中，磷脂（PLs）和三酰甘油（TAGs）是细胞脂质的主要成分。动态降解三酰甘油（ddTAG）策略是一种代谢工程方法，可动态调节细胞内TAG代谢以增强阿维菌素等次级代谢产物的产量。本研究构建了两个质粒pCu-TAG和pKas-TAG，分别利用强启动子kasop*和诱导型启动子cumate调控长链脂肪酸-CoA连接酶编码基因sco6196的表达。薄层色谱（TLC）分析表明，发酵过程中细胞内TAG水平显著下降，为应用ddTAG策略提供了基础条件。发酵验证结果显示，在培养第1天用50 μM库马特诱导时，多杀菌素产量从279.5 mg·L^?1增加至345.7 mg·L^?1，增幅为23.7%。

在多刺糖多孢菌中引入人工NCM途径

多杀菌素是一种源于酰基辅酶A的聚酮化合物，其生产与细胞内乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A等水平密切相关。天然酰基辅酶A主要通过ACC途径合成，该途径伴随碳损失和复杂调控。人工非羧化性丙二酰辅酶A（NCM）途径可高效合成中心代谢物丙二酰辅酶A及其衍生的次级代谢产物。本研究利用β-葡萄糖醛酸酶（gusA）报告系统评估了ermE, kasop, J23119, SP43等启动子的强度，发现SP43的强度是kasop*的4–6倍。随后将NCM相关基因BauA和MCR-C整合到pSET152载体中，并在不同强度的启动子控制下构建了多种NCM表达载体。发酵验证显示，引入NCM途径显著提高了多杀菌素产量，且与启动子强度正相关。其中，NHF132-SP43-NCM的效价达到682.2 mg·L^?1，较野生型提高了158.8%。

利用内源性I型CRISPR/Cas系统敲除多刺糖多孢菌中的竞争性BGC

消除非目标BGC是提高天然产物产量的经典策略。本研究利用antiSMASH分析了多刺糖多孢菌NHF132的基因组，鉴定出37个潜在的BGC，并最终选择了Ery（区域14）、Fla样（区域17）和Ges（区域21）这三个转录水平较高的BGC进行敲除。利用内源性I型CRISPR/Cas系统和同源重组技术，成功构建了三个敲除质粒并获得敲除菌株。发酵测试表明，敲除Fla样和Ges BGC反而降低了多杀菌素产量，而敲除Ery BGC并未显著提高产量。

多杀菌素生产的组合代谢工程策略

从Spn-GEM的预测靶点可知，多杀菌素的生物合成与氨基酸、核苷酸和碳水化合物代谢密切相关。本研究测试了可将前体补充、BGC过表达和底盘重构归为三类的多种策略。将ddTAG策略与NCM途径结合的菌株NHF132-TAG-NCM仅使多杀菌素产量提高了29.1%。而将鼠李糖过表达、BAC倍增和人工NCM途径三者系统性地结合，则显示出协同增强效应。菌株NHF132-BAC-SP43-NCM在摇瓶培养中实现了1405.4 mg·L^?1的多杀菌素效价，较野生型提高了429.2%。qPCR和全转录组RNA-seq结果均证实了相关基因表达水平的大幅提升。

多刺糖多孢菌培养的培养基和发酵过程优化

优化培养基和发酵条件是提高天然产物产量的有效策略。本研究首先优化了碳源中的植物油组分，发现大豆油是最佳碳源。在培养基中添加400 mg·L^?1 Tween 80可使多杀菌素产量从269.3 mg·L^?1提升至397.1 mg·L^?1，增幅达47.5%。为了模拟工业化生产条件，将高产菌株NHF132-BAC-SP43-NCM在生物反应器中培养。通过补料分批培养，将pH维持在7左右，溶解氧（DO）保持在较高水平（>50%）。基于优化的培养基条件，NHF132-BAC-SP43-NCM的发酵效价达到1816.8 mg·L^?1，较原始发酵条件提高了29.3%，较原始出发菌株提高了553.3%。