基于群体感应的工程益生菌联合体用于结直肠癌免疫治疗

本刊推荐：本研究创新性地构建了一种基于正交群体感应（QS）系统的工程益生菌联合体EcNPAQ，可智能响应肿瘤微环境（TME）中低pH、缺氧及高乳酸信号，并动态调控乳酸脱氢酶（LdhA）和抗PD-L1纳米抗体（anti-PD-L1nb）的时序性释放。该联合体通过代谢重编程（降低乳酸水平）与免疫检查点阻断（靶向PD-1/PD-L1通路）的双重协同机制，在两种人源化小鼠模型中均显著抑制了肿瘤生长并激活了T细胞抗肿瘤免疫，为活体生物治疗产品（LBP）的开发提供了模块化平台。

　　

引言

结直肠癌（CRC）是全球第三大常见癌症，年新增病例约190万，死亡病例约90万，是癌症相关死亡的第二大原因。近年来，免疫检查点抑制剂（ICIs），特别是靶向程序性死亡蛋白1（PD-1）及其配体（PD-L1）通路的中和抗体（如pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab等），在临床应用中显示出巨大的潜力。然而，许多CRC患者对免疫治疗产生耐药性，其应答率仅在13%至69%之间。耐药原因主要包括：传统全长抗PD-L1抗体肿瘤穿透性有限；肿瘤微环境（TME）中高乳酸水平诱导PD-L1激活并促进免疫抑制；以及单菌株疗法缺乏精确调控机制和令人满意的体内安全性。

为克服这些挑战，本研究旨在构建一个智能的工程益生菌联合体，利用正交群体感应（QS）系统整合多种TME信号，并协调多种治疗性载荷的释放。

设计及工程化部件与模块的表征

研究首先重新利用了来自大肠杆菌F质粒的ccdAB毒素-抗毒素系统来实现可控的细菌裂解。其中，ccdB毒素由组成型启动子J23114表达，而ccdA抗毒素由阿拉伯糖诱导的pBAD启动子表达。实验证实，该体系可实现EcN中可调的裂解，在≥1.5%阿拉伯糖浓度下可维持细菌存活。

为区分TME，研究针对三个病理信号开发了模块化生物传感器：缺氧、酸性pH和高乳酸水平。

• •
  缺氧传感器：利用氧响应转录因子FNR（呋喃酸和硝酸盐还原调节因子）。在缺氧条件下，FNR形成转录活性同源二聚体。筛选了四个FNR依赖性启动子（pFNRS, pFF+20, pPepT, pVgb），最终确定pFF+20在缺氧条件下诱导sfGFP表达最强，且荧光强度与氧浓度呈负相关。
• •
  pH传感器：利用膜锚定的pH传感转录调节因子CadC及其调控的pCadC启动子。该传感器在酸性环境（与中性pH相比）中表现出更高的活性，并在生理相关的肿瘤pH范围内被激活。
• •
  乳酸传感器：基于lldPRD操纵子的天然调控机制。该系统结合了乳酸响应启动子pLldR（驱动sfGFP）和组成型表达的乳酸结合阻遏蛋白LldR。在5 mM L-乳酸浓度下诱导达到最大，超过此浓度则因生长抑制导致传感器输出下降。

为实现同时降解乳酸和释放抗PD-L1nb的双重功能，研究旨在创建一个由两种具有互补功能的工程化EcN菌株组成的工程益生菌联合体。这需要实施两个正交的QS系统以防止信号串扰。通过对包括TraI/TraR（来自根癌农杆菌，配体3OC8-HSL）、LasI/LasR（来自铜绿假单胞菌，配体3OC12-HSL）、LuxI/LuxR（来自费氏弧菌，配体3OC6-HSL）和RpaI/RpaR（来自沼泽红假单胞菌，配体pC-HSL）在内的多种系统进行评估，最终选择在浓度范围内表现出最佳信号正交性的LasR-plux和TraR-ptra系统用于构建联合体。

最后，研究比较了两种不同的酶系统：LdhA（一种NAD⁺依赖性乳酸脱氢酶，催化丙酮酸形成并将NAD⁺还原为NADH）和LldD（一种细胞色素c连接的脱氢酶，通过高铁细胞色素c还原来介导乳酸氧化）。通过一系列染色体重组和基于质粒的互补实验，构建了EcN1 (ΔlldD)、EcN2 (ΔldhA)、EcN3 (ΔlldDΔldhA)等菌株。遗传互补产生了EcN1-ldhA (ΔlldD/ldhA⁺)、EcN2-lldD (ΔldhA/lldD⁺)和EcN-ldhA-lldD (ldhA⁺/lldD⁺)菌株。在5 mM乳酸中培养2小时后，EcN1-ldhA菌株表现出最有效的乳酸清除率，使细胞外乳酸减少了22.37%。这种优越的性能可能源于消除了竞争性的LldD介导的电子流。因此，选择具有增强LdhA表达的EcN1-ldhA底盘作为后续应用的平台。

用于治疗CRC的智能工程益生菌联合体的设计

研究整合了上述环境信号传感模块、治疗分子生产模块和群体行为调节模块（QS系统），创建了一个名为EcNPAQ（带有抗PD-L1nb、乳酸脱氢酶和QS系统的EcN）的智能工程益生菌联合体，用于CRC治疗。EcNPAQ被设计用于定植肿瘤，并有效感知CRC的酸性、缺氧和高乳酸TME。该联合体包含两个关键组成部分：EcNLA（带有乳酸脱氢酶的EcN），可在适当时间降解乳酸；EcNPD（带有抗PD-L1nb的EcN），通过周期性积累和释放抗PD-L1nb来发挥治疗作用。这两种菌株动态相互作用，维持平衡的生态系统。

为了调节两个微生物群体之间的动态平衡，研究受捕食者-猎物合成基因回路系统的启发，模拟自然种群振荡，并通过两个QS模块（LuxI/LuxR和LasI/LasR）实现密度稳态。EcNLA和EcNPD均转化了两个工程质粒。此外，在EcNLA基因组中敲除了lldD基因。

在该系统中：

1. 1.
   EcNLA可在高乳酸条件下激活pLldR启动子，诱导乳酸消耗酶LdhA的表达。由于LdhA在细胞内积累，它只能消耗通过乳酸转运蛋白MCTs进入细胞的细胞内乳酸。高乳酸TME抑制免疫细胞功能，从而抑制PD-1/PD-L1免疫疗法的疗效。
2. 2.
   EcNLA也可在酸性环境中激活pCadC启动子，导致ccdB表达，从而触发EcNLA裂解并将LdhA释放到肿瘤中。这有助于降低TME中的乳酸水平并调节肿瘤内的代谢环境。同时，EcNLA的密度降低。
3. 3.
   EcNLA密度的降低导致LuxI信号分子产生减少，阻止EcNPD中的pLux启动子表达ccdB，使得EcNPD能够持续增殖。同时，pFF+20启动子响应厌氧条件并持续产生PD-L1nb。
4. 4.
   当EcNPD达到高密度时，它产生TraI信号分子，这些分子扩散到EcNLA中并与TraR结合。这诱导了EcNLA中ccdA的表达，中和了ccdB，防止进一步裂解，并允许EcNLA密度逐渐恢复。
5. 5.
   随着EcNLA密度的增加，它产生丰富的LuxI信号，扩散到EcNPD中。在那里，LuxI与LasR结合并激活pLux启动子，驱动ccdB的表达。这触发了EcNPD的广泛裂解，将积累的PD-L1nb释放到肿瘤中以发挥免疫治疗作用。

研究评估了EcNPAQ的乳酸降解能力。在2、4、6和8 mM乳酸浓度下孵育2小时，乳酸降解率随乳酸浓度增加而降低，在2 mM浓度下达到最大速率36.92%。在4、6和8 mM浓度下，较高的初始乳酸浓度导致较低的乳酸降解率。

接下来，评估了EcNPAQ中抗PD-L1nb的表达能力。离心过夜培养的EcNPD和EcNPAQ培养物，分别收集上清液和沉淀。结果表明，在EcNPD培养物中，上清液几乎不含抗体，而沉淀中有大量积累；而在EcNPAQ培养物中，抗PD-L1nb主要存在于上清液中，表明有效积累和释放。

在模拟厌氧、低pH和高乳酸条件的实验中，发现当EcNLA与EcNPD的初始比例为1:1时，未观察到振荡行为。利用修正的Lotka-Volterra方程进行计算机模拟，评估了100:1、10:1、1:1、1:10和1:100的初始比例，发现1:100的比例最有效和最稳定。因此，选择EcNLA与EcNPD的初始比例为1:100作为实验条件。

最后，测试了EcNPAQ在复杂环境下周期性振荡的能力。EcNPAQ在1 L发酵罐中培养，并在3天内每天取样两次。实验设置涉及pH 5.5的厌氧培养，乳酸浓度稳定在2 mM。EcNLA以1:10000的比例接种，而EcNPD以1:100的比例接种。在72小时内，抗PD-L1nb浓度随时间增加。EcNLA和EcNPD均表现出同步振荡，达到循环动态平衡，持续积累和释放乳酸脱氢酶和抗PD-L1nb。通过共聚焦荧光图像定量分析荧光面积，也揭示了类似的动态平衡。振荡幅度逐渐减小，频率约为24小时。

生理环境中的生物传感器及通过巨噬细胞吞噬作用测量的EcNPAQ治疗效果

为了表征体内细菌生物传感器，首先评估了它们感知哺乳动物细胞培养物代谢活性的能力。收集培养4天的HT-29细胞培养基上清液，测量L-乳酸和pH水平。随后，将含有生物传感器的细菌（pFF+20-sfGFP、pCadC-sfGFP和pLldR-sfGFP）在收集的上清液中培养16小时后测量荧光。观察到细菌荧光信号显著增加，与较高的乳酸浓度和较低的pH水平相对应。细菌在常氧和缺氧条件下的上清液中过夜孵育，显示仅在缺氧环境下存在高荧光信号。这些结果表明细菌生物传感器可以有效检测生理环境中的生化特征。使用Transwell共培养系统（HT-29细胞和EcNPAQ）证明，EcNPAQ可以在生理环境下消耗乳酸并释放PD-L1nb。

先前的研究表明，抗PD-L1抗体可显著增强体内巨噬细胞的增殖和浸润，促进促炎表型。本研究评估了活化巨噬细胞对结肠癌细胞的吞噬率。巨噬细胞和HT-29细胞共培养实验在上述TME模拟条件下进行。将不同时间点的EcN或EcNPAQ上清液与HT-29细胞共培养后，利用共聚焦显微镜评估巨噬细胞吞噬率。分析了一百多个图像，并随机选择一百个蓝色荧光巨噬细胞进行定量，那些显示红蓝合并荧光的表明发生了吞噬。各组间的吞噬率存在显著差异，EcNPAQ上清液实现了约27.39%的吞噬率，而EcN组为7.38%。巨噬细胞吞噬作用的增加表明抗PD-L1nb以组合、剂量依赖的方式增强了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。此外，用10^?6 M LuxI信号培养EcNPD，用10^?6 M TraI信号培养EcNLA。48小时后收集EcNPD和EcNLA的上清液。与EcNPAQ组观察到的吞噬率相比，仅释放PD-L1nb的EcNPD组显示出较低的吞噬率，而仅释放LdhA的EcNLA组并未增加吞噬率。

在人源化PD-1小鼠模型中EcNPAQ对MC38肿瘤的抗肿瘤疗效

为了进一步验证EcNPAQ的体内抗肿瘤活性，使用携带hPD-L1 MC38肿瘤的hPD-1敲入小鼠模型进行了治疗实验。每两天监测一次肿瘤体积和体重。结果表明，EcN表现出一定程度的抗肿瘤活性，而EcNPAQ治疗与EcN组相比显著延迟了肿瘤进展，表明其肿瘤抑制能力增强。各组体重保持稳定，表明没有系统性毒性。此外，在EcNPAQ治疗组中检测到较低的乳酸水平，证明EcNPAQ消耗了瘤内乳酸，这可以增强PD-L1nb的治疗效果。然后，切除1g肿瘤组织，WB实验证明EcNPAQ在体内表达了His标签抗PD-L1nb。

CD8⁺ T细胞已被确定为抑制PD-1/PD-L1通路的主要效应细胞，从而激活免疫应答。肿瘤内肿瘤特异性CD8⁺ T细胞的浸润是有效免疫治疗的关键指标，IFN-γ是CD8⁺ T细胞浸润的重要生物标志物。此外，IL-2是T细胞的关键生长因子，用于评估T细胞增殖和浸润。通过ELISA测量小鼠IL-2和小鼠IFN-γ的血清水平，以评估治疗在阻断PD-1/PD-L1通路方面的疗效。研究发现，与EcN组相比，EcNPAQ组的mIL-2和mIFN-γ水平显著升高，表明与抗肿瘤免疫反应相关的细胞因子分泌增强。为了排除全身传播，评估了EcNPAQ的生物分布。通过平板计数和qRT-PCR计算了 homogenized 肿瘤、肝脏和脾脏中的EcN。证实细菌生长仅限于肿瘤，在治疗小鼠的肝脏和脾脏中未检测到细菌（低于检测限，约1 × 10³菌落形成单位（CFU））。由于EcNPAQ中两种菌株的持续振荡和裂解，肿瘤中的细菌数量少于EcN。免疫组化分析显示，与EcN组相比，EcNPAQ组肿瘤浸润小鼠CD8⁺ T细胞显著增加，表明EcNPAQ处理的肿瘤组织中mCD8⁺ T细胞浸润增强。此外，mKi67⁺细胞是肿瘤细胞增殖的关键标志物，存在于细胞周期的所有活跃阶段。与EcN组相比，EcNPAQ组中mKi67⁺细胞的表达显著降低。

为了进一步阐明在EcNPAQ治疗组中观察到的体内效应，将肿瘤组织消化成单细胞悬液，并使用流式细胞术分析肿瘤中的浸润免疫细胞。结果表明，EcN对肿瘤在一定程度上发挥了内在的积极作用，而EcNPAQ产生了强大的系统性抗肿瘤疗效。与NS组和EcN组相比，EcNPAQ组肿瘤组织中mCD45⁺细胞的比例增加。值得注意的是，EcNPAQ组中mCD3⁺、mCD4⁺和mCD8⁺ T细胞的比例显著升高。这表明EcNPAQ通过阻断PD-1/PD-L1通路抑制肿瘤生长，进一步促进T细胞浸润到肿瘤组织中。此外，评估了肿瘤组织中产生mIFN-γ的CD8⁺ T细胞的比例，发现与其他治疗组相比，EcNPAQ组中该群体显著增加。调节性T细胞（T_regs），以Foxp3为标志，通过创建免疫抑制性TME促进肿瘤免疫逃逸。在用PE标记的小鼠Foxp3抗体孵育后，观察到EcNPAQ组中mFoxp3⁺ T细胞的比例为1.82%，而NS组为4.34%，表明免疫抑制性TME处于激活状态。这些发现共同表明EcNPAQ增强了抗肿瘤 immunity。EcNPAQ优于EcN的疗效突出了其工程化设计的治疗优势，可能是通过协同调节肿瘤免疫景观实现的。

在人源化PBMC小鼠模型中EcNPAQ对HT-29肿瘤的抗肿瘤疗效

尽管人PD-1小鼠模型携带人PD-L1 MC38肿瘤是一种有效的人源化动物模型，但同系小鼠模型难以重现人类癌症的许多特征，如进行性癌变和异质性。为了克服这些限制，一个经典策略是使用人类肿瘤细胞系与外周血单核细胞（PBMC）人源化的NSG小鼠模型相结合。为了评估EcNPAQ的治疗潜力，我们采用了移植了人PBMC的人源化NSG小鼠模型。PBMC移植三天后，通过皮下注射建立HT-29人结直肠肿瘤。两周后，脾脏中人CD45⁺细胞的比例从52.2%到63.1%不等，这证实了人源化小鼠模型的成功构建。小鼠分别瘤内注射生理盐水（NS）、EcN或EcNPAQ进行治疗。监测肿瘤体积和体重直至小鼠被安乐死。与EcN组和NS组相比，EcNPAQ治疗显著延迟了肿瘤进展。各组体重保持稳定，表明没有系统性毒性。此外，观察到EcNPAQ消耗了瘤内乳酸，并在体内表达了His标签抗PD-L1nb。

细胞因子，如人IL-2和人IFN-γ，是T细胞激活的关键生物标志物。血清分析显示，与EcN相比，EcNPAQ治疗的小鼠的hIL-2和hIFN-γ水平显著升高。这些发现与先前的研究一致，表明细胞因子驱动的T细胞增殖增强了肿瘤清除。为了确认生物安全性，对 homogenized 的器官和肿瘤进行了培养。EcNPAQ定植仅限于肿瘤，未检测到向肝脏或脾脏的传播。同样，EcNPAQ组肿瘤中的细菌数量少于EcN组。

通过流式细胞术分析解离的肿瘤的单细胞悬液。在人源化PBMC小鼠模型中，hCD8⁺ T细胞、hCD4⁺ T细胞、hCD8⁺hINF-γ⁺ T细胞和hCD4⁺hFoxp3⁺ T细胞的设门策略与前述一致，但使用了抗人抗体。值得注意的是，EcNPAQ扩增了hCD8⁺ T细胞、hCD4⁺ T细胞和hIFN-γ⁺hCD8⁺ T细胞，表明肿瘤组织中T细胞的浸润显著增强。并且观察到hFoxp3⁺ T细胞的比例为0.76%，而NS组为1.78%，证明EcNPAQ克服了免疫抑制性肿瘤微环境。在EcNPAQ组中观察到的改善的肿瘤抑制可能是由于瘤内T细胞的浸润和增殖。总之，这些结果表明基于QS的工程益生菌联合体可以产生强大的、肿瘤特异性的适应性免疫反应。

结论与讨论

为了解决免疫治疗中组织渗透性差、系统毒性和免疫抑制性TME等挑战，当前研究集中于用于疾病诊断和治疗的工程化单菌株。本研究选择开发一种工程益生菌联合体EcNPAQ。其优势包括：1) pH（CadC）、缺氧（FNR）和乳酸（LldR）传感器触发裂解，从而将治疗分子与肿瘤生理学相结合；2) LasR-plux和TraR-ptra正交QS系统，确保信号特异性并模拟生态动力学；以及3) 乳酸脱氢酶和抗PD-L1nb的协同释放。因此，EcNPAQ能够在TME中精确递送治疗分子，增强生物安全性和特异性。此外，使用修正的Lotka-Volterra模型优化初始微生物组成，提高了振荡的稳定性和递送的可行性。

选择EcN作为治疗底盘是出于各种生物学特性。EcN重组肠道微生物生态以增强T细胞浸润到肿瘤中，并增强PD-1/PD-L1检查点封锁的疗效。此外，其厌氧趋化性使其能够选择性定植缺氧肿瘤，绕过限制药物递送的网状内皮系统（RES）清除机制。

在构建工程微生物联合体时，研究人员通常引入共生或合作相互作用以优化目标产物的代谢通量并确保系统稳定性。然而，EcNPAQ exemplifies 竞争性相互作用，其中两种细菌模拟自然生态系统中的捕食者-猎物动态，稳定裂解以释放治疗分子。这种方法不仅提高了治疗人类肠道疾病的安全性，而且允许根据特定条件调整两种菌株的比例，通过两种治疗分子的协同作用实现更好的治疗效果。

TME中的高乳酸水平有助于肿瘤进展和转移，而降低乳酸浓度可改善细胞毒性T细胞功能，从而增强PD-L1免疫疗法的敏感性。为了进一步增强免疫治疗，我们设计了EcNPAQ来精确生产ldhA和抗PD-L1nb，协同靶向免疫逃避和代谢免疫抑制。基于这些发现，我们假设EcNPAQ可以促进T细胞浸润到肿瘤组织并抑制肿瘤生长。

为了检验这一假设，我们在人源化PD-1小鼠模型和人源化PBMC小鼠模型中评估了EcNPAQ的治疗效果。迫切需要评估工程细菌递送系统在人源化小鼠模型中的治疗效果。尽管这些模型具有有限的免疫库，不能完全复制人类免疫系统的复杂性，但它们也为评估治疗效果提供了更有效的平台。肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）对于介导抗肿瘤免疫反应至关重要，其密度和分布影响各种癌症患者的预后。EcNPAQ组中CD8⁺ T细胞和CD4⁺ T细胞比例的增加启动了强烈的T细胞介导的抗肿瘤反应。此外，CD8⁺IFNγ⁺ T细胞水平升高与CRC患者改善的预后相关。IFNγ⁺ T细胞的显著增加也促进了巨噬细胞从M2表型向M1表型的极化，进一步增强了树突状细胞成熟和抗肿瘤 immunity。此外，肿瘤组织中CD4⁺Foxp3⁺调节性T细胞（Tregs）的减少表明肿瘤的免疫抑制微环境受到抑制，增强了整体抗肿瘤免疫反应。这些结果反映了PD-1/PD-L1阻断研究中的发现，其中T_regs耗竭与CD8⁺ T细胞浸润协同克服免疫逃避。

尽管我们的实验已经证明了EcNPAQ的抗肿瘤功效，但其治疗效果尚未在具有高PD-1表达的癌细胞的原位肿瘤模型和口服给药中得到验证。此外，我们将评估仅表达抗PD-L1nb的EcN、仅表达LdhA的EcN和EcNPAQ的治疗效果。它可以证明，在工程细菌治疗中，乳酸降解与PD-L1nb结合也具有当前文章中报道的协同效应。此外，我们将优化乳酸脱氢酶和抗PD-L1nb释放之间的平衡，以进一步增强联合治疗效果。

这个高度模块化的系统作为一个持久稳定的平台。未来，该平台可以适应响应肿瘤学以外的疾病信号，通过集成遗传电路提供精确的治疗解决方案。然而，这在靶向细菌递送和最小化体内毒性方面提出了挑战。例如，EcNPAQ可以被设计为响应硫代硫酸盐信号，从而能够产生免疫调节蛋白、酶或抗炎细胞因子用于治疗肠道炎症。该联合体系统的另一个有前景的应用是递送ICIs和肿瘤新抗原，这可以使用工程细菌作为载体实现个性化癌症疫苗的开发。通过对微生物载体进行编程并将其与其他免疫疗法相结合，EcNPAQ可以提供一个可靠有效的平台来根除原发性和转移性实体瘤。益生菌疗法显示出快速临床转化的强大潜力，通过肠溶胶囊、磁性或声遗传学控制的靶向递送等方法得以促进。

总之，我们预计工程益生菌联合体将为精准医学开辟新途径，迎来可控和基因工程益生菌治疗的时代。