综述：眼科细胞治疗系统的3D生物打印：从生物工程组织到个性化药物递送

本综述系统探讨了3D生物打印技术在眼科细胞治疗领域的突破性应用。文章详细分析了挤出式、激光辅助及喷墨式三大生物打印技术的特点，展示了其在构建仿生角膜/视网膜组织及封装细胞治疗（ECT）装置方面的卓越潜力。通过结合干细胞（如iPSCs、MSCs）与智能生物材料（如Kuragel水凝胶），该技术有效解决了细胞移植后的存活率低、组织整合差及长期疗效维持等关键难题，为个性化眼科再生医学提供了全新解决方案。

　　

3D生物打印技术

3D生物打印作为再生医学领域的革命性技术，通过逐层沉积包含细胞的生物材料，能够构建具有复杂结构的生物系统。该技术不仅可制造功能性组织（如血管、肌肉），还能开发个性化药物递送系统。在眼科领域，其价值尤为突出——能够以微米级精度制造分层组织及患者特异性移植物，同时显著降低免疫排斥风险。这些特性推动了可植入组织、药物测试模型及细胞载药治疗系统的快速发展。

目前主流技术包括挤出式、激光辅助和喷墨式生物打印（表1）。每种技术各有优劣，但均能实现小规模个性化治疗。打印方法需根据目标结构特性选择，并通过调整材料粘度、喷嘴尺寸、打印压力等参数精确控制外部形态与内部特征（如孔隙率、连通性）。这些因素对维持细胞所需的氧气营养供应及组织功能整合至关重要。

新兴的浴打印技术通过在打印过程中提供结构支撑，实现了复杂几何结构的制造。其水环境特性还有助于延长细胞存活时间。打印构建的结构能有效支持移植细胞或募集细胞的附着、生长及生理功能维持。

用于眼科细胞治疗的细胞类型及其与3D生物打印的结合潜力

成功的眼科3D生物打印治疗依赖于具有强大治疗潜力的细胞源（图2和表2）。干细胞凭借其自我更新和分化为特定 ocular 细胞类型（包括上皮细胞、光感受器和内皮细胞）的能力，成为核心选择。胚胎干细胞（ESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）作为多能干细胞，在再生治疗中潜力巨大，但ESCs存在伦理问题。相比之下，间充质干细胞（MSCs）具有分化为成体细胞类型的能力，其特性因组织来源（如牙髓、骨髓、脂肪组织）而异。其强大的免疫抑制特性以及相较于ESCs和iPSCs更低的致瘤风险，使其在治疗应用中更具优势。

非干细胞在再生医学中通过利用其固有细胞功能，避免了伦理争议，降低了致瘤风险，并使用自体（患者来源）细胞减少了免疫原性。口腔黏膜上皮细胞（OMECs）、外周血单核细胞（PBMCs）、角膜缘上皮细胞、角膜内皮细胞、光感受器前体细胞和视网膜色素上皮（RPE）是自体移植治疗的理想选择。同种异体（供体）视网膜色素上皮（ARPE19）因其低致瘤性和低免疫原性，非常适合表达治疗性蛋白（如神经营养因子或VEGF受体）。此外，基因修饰细胞可通过递送局部治疗分子、纠正基因缺陷、改善功能整合和降低移植后免疫排斥风险来优化治疗效果。

将上述治疗细胞成功整合到3D生物打印技术中，需考虑几个关键属性：支持活细胞生长和存活的能力（细胞活力）、执行组织所需特化功能的能力（功能性）以及确保与机体安全相互作用（生物相容性）。细胞活力是3D生物打印的关键因素。维持高细胞活力具有挑战性，尤其是对于干细胞或原代细胞，它们对环境压力敏感，并可能进一步影响细胞信号传导和蛋白表达。在挤出式生物打印中，降低挤出压力和使用更大孔径喷嘴是减少细胞应激的改进策略。SLA和DLP使用LED光源的光交联材料代替细胞毒性的UV激活交联剂。此外，使用天然衍生聚合物（如藻酸盐、胶原蛋白、明胶）或可注射脱细胞细胞外基质（dECM）可以创造有利于细胞存活的环境。

为了模拟靶组织特异性细胞外基质（ECM），开发了基于水凝胶的支架。Agrawal等人开发的Kuragel是一种可光交联的水凝胶，是理想的牺牲基质（3D打印中的临时结构），通过提供熟悉的ECM特性促进角膜再生，从而支持基质细胞存活。工程化水凝胶也被用于在体内生长微血管网络，作为模拟ECM的宝贵工具。交联胶原蛋白水凝胶被发现可生成内皮细胞介导的血管网络，这是细胞递送策略的重要设计。3D打印组织的功能性是另一个需要进一步关注的关键挑战。实现功能性3D打印组织取决于构建物内嵌入细胞的生物学行为。Tan等人证明，机械信号如循环拉伸可以指导细胞生长和谱系特异性分化，正如角膜成纤维细胞在拉伸下保持形状所示。将生物活性分子（如胶质细胞源性神经营养因子（GDNF））加入生物墨水可以进一步增强组织再生。控制细胞组织（如细胞空间分布和排列）也是影响细胞行为的关键因素。Samandari等人通过包含GelMA（用于辅助细胞生长）和藻酸盐（用于在细胞成熟过程中提供细胞排列）的微区室化系统解决了这一挑战。这些因素本质上可以促进细胞活动，支持组织再生，并有助于建立更具生理相关性的环境。

生物相容性是决定3D打印生物材料可行性的重要因素。因此，3D打印构建物需要无毒、无免疫原性、无致癌性，并排除任何不良的局部或全身效应。如前所述，选择无毒材料并在打印后实施纯化过程以消除有毒残留物或溶剂，对于避免全身毒性至关重要。如果材料是可生物降解的，其副产物同样需要如此行为以防止严重反应。除毒性外，此类反应还可能由异物、结构和细胞引起炎症反应。为了缓解这种情况，已经研究了注入免疫调节细胞和免疫抑制分子。MSCs可以通过与各种免疫细胞类型（如单核细胞和中性粒细胞）的细胞间相互作用改善组织再生过程中的免疫调节。MSCs和hESC衍生的RPE细胞可以在体外抑制活化T细胞的增殖，减少促炎细胞因子（如干扰素-γ）的分泌，并增强T细胞凋亡。加入免疫抑制分子如环孢素A或他克莫司可以进一步阻止急性细胞排斥反应，特别是在高风险角膜移植中。除了联合治疗（如在I-II期试验中测试的造血干细胞和Tr1细胞疗法）可能克服个体局限性并利用独特的免疫耐受特性外，调节3D打印后生物材料的表面特性有助于通过促进干细胞完全分化来降低致瘤风险。例如，表面修饰，特别是带有官能团的自组装单分子层（SAMs），已被发现可增强细胞-生物材料相互作用并诱导干细胞分化。这些策略可能潜在地应用于推进3D打印应用。

3D生物打印的眼科组织与设备

如前一节所述，针对不同材料和细胞有多种3D生物打印选项，因此可用于快速制造生物原型并根据患者需求进行定制。基于这些优势，3D生物打印是复制组织复杂微观结构的理想选择。许多研究人员已开发出3D生物打印的功能性组织和相关设备。因此，本节探讨眼科组织和眼科设备的3D生物打印。

3D生物打印的眼科组织

角膜

角膜由上皮、基质、内皮、鲍曼层和德斯密膜组成。由于角膜的透明度、曲率和分层细胞结构，模仿天然角膜结构对组织打印来说具有挑战性。Sorkio等人开发了一种激光辅助3D生物打印策略，使用人类干细胞和生物活性胶原基水凝胶制造角膜组织构建物（图3a）。该研究使用胶原蛋白和两种细胞：人类胚胎干细胞衍生的角膜缘上皮干细胞用于打印模仿上皮结构，人类脂肪组织衍生的干细胞用于构建分层模仿基质结构。打印的组织表现出理想的机械性能、高细胞活力以及与天然组织相当的透明度。Kim及其同事利用挤出式3D打印产生的剪切应力，诱导生物工程角膜基质构建物内胶原纤维的排列（图3b）。这种剪切诱导的排列模仿了天然基质的各向异性微观结构，显著提高了透明度和机械强度。此外，封装在角膜来源的脱细胞细胞外基质中的人角膜角质细胞前体对排列的基质反应良好，导致高细胞活性和沿纤维取向的伸长，模仿了角膜组织功能。最近，基于SPAAC（应变促进的叠氮-炔环加成）的胶原蛋白生物墨水由于其生理条件下快速交联和优异的细胞相容性，被开发用于角膜重建。这些材料展示了高结构完整性并通过嵌入式浴打印策略精确控制微尺度孔隙率，促进了封装角膜间充质基质细胞的伸长和铺展。这种方法在3D生物打印构建物中复制天然角膜基质的机械和结构特征以及开发眼科药物递送系统方面具有巨大潜力。

除了可植入组织，体外平台在3D组织打印的辅助下能更好地模拟真实器官的运作。这可用于定制化细胞研究、疾病建模和药物开发。例如，角膜曲率影响细胞排列。使用传统方法难以制造或定制曲率，但通过3D生物打印可以轻松制造。通过3D打印，开发了一种经济实惠且可定制的角膜灌注室，用于在生理相关条件下维持离体角膜组织，实现对眼内压力和营养输送的精确控制，用于角膜研究。尽管研究中疾病模型有限，但该系统适应性强，在眼科药物测试、疾病建模和移植研究方面具有巨大潜力。

4D打印（指3D打印模型随刺激发生变化）也被应用。通过调节柠檬酸钠与海藻酸钠的摩尔比，打印出具有可控降解性的细胞负载组织构建物。封装在这些构建物中的人角膜上皮细胞（HCECs）表现出增加的增殖率和更高的细胞角蛋白3（CK3）表达，表明随着降解增强，细胞活性得到改善。这种方法评估了3D打印支架降解特性对细胞行为的影响，旨在优化生物墨水系统以改善组织工程应用的结果。

视网膜

视网膜是复杂的多层组织，负责收集和处理光信号，然后将信号传输到大脑进行进一步处理。通过使用成熟的光感受器、祖细胞、视网膜片和视网膜色素上皮（RPE）细胞，视网膜再生治疗前景广阔。对于再生，首先，光感受器/RPE层的组织、极化和排列对组织功能至关重要。其次，必须确保细胞活力，因为植入会导致细胞损失。3D生物打印已被证明有助于改善组织结构和细胞植入后的活力。

挤出式3D打印用于在视网膜构建物内空间组织RPE细胞球体，模仿天然视网膜组织的分层结构。打印的球体保持高活力，表达特征性RPE标志物，并形成单层样结构，这可能作为进一步研究的有前景的视网膜模型。Masaeli等人利用基于喷墨的生物打印策略将成熟和分化的光感受器沉积到打印的RPE层上，其中一层薄薄的明胶甲基丙烯酸酯作为布鲁赫膜。结果显示，随着时间的推移形成了功能性的RPE单层，并且微观结构建立良好，这有望作为疾病研究的体外模型。

许多体外视网膜平台也被建立用于研究。使用挤出式3D打印生物活性基底膜衍生的dECM来实现单层RPE打印。优化3%明胶作为生物墨水中的牺牲材料以支持单层RPE细胞沉积，并在凝胶化后最终移除，留下一个存活且附着良好的RPE层（图3c）。建立了一个高度功能性的、仿生的体外血视网膜外屏障模型，与传统模型相比，提供了优异的细胞相容性、屏障完整性和生理相关性。该模型在烟雾诱导的视网膜色素上皮变性中进行了评估。类似的打印方法与人米勒胶质细胞（MIO-M1）被应用于构建基于MIO-M1的视网膜保护模型。Song等人在定制的PLGA支架上打印温度敏感的、基于纤维蛋白的生物墨水，模仿了RPE、内皮细胞、周细胞和成纤维细胞之间的基本细胞结构和相互作用。所提出的平台模拟了健康视网膜组织的关键特征以及疾病模型，如年龄相关性黄斑变性中的玻璃膜疣形成和脉络膜新生血管。

其他

3D打印在制造其他眼科组织方面也非常重要，例如眶内植入物和眼内透镜（IOL）。先进成像、计算机辅助设计和增材制造相结合，促进了个性化手术解决方案，并提高了眼科植入物在结构和光学方面的精确性和适应性。

3D生物打印的眼科设备

除了上述组织工程，3D生物打印还为细胞结合的眼科设备领域提供了更多选择。例如，直接接触泪液的隐形眼镜被认为是疾病诊断和治疗的优秀平台，并可通过3D打印定制。Lee等人使用3D生物打印技术制造了一种微轮廓隐形眼镜，用于固定和转移ABCB5阳性角膜缘干细胞到角膜表面（图3d）。打印镜片的定制化设计和制造确保了其与角膜的紧密附着，并提高了干细胞的有效递送和植入。这项工作表明，3D打印隐形眼镜是传统自体干细胞移植技术的有前景的替代方案，用于角膜上皮再生和视力恢复治疗角膜缘干细胞缺乏症。

此外，3D打印通过增加药物几何形状到释放曲线的复杂性，在药物递送方面提供了优势。它允许个性化药物制备，包括剂量、药物组合和载药植入物。3D打印的按需生产减少了浪费，并促进了靶向递送，特别是在难以到达的组织中。这些能力使3D打印成为下一代药物制剂和个体化治疗的强大方法。例如，Xu等人3D打印了用于个性化眼部药物递送的泪点塞（图3e）。研究人员使用Balb/3T3成纤维细胞评估了打印塞子的细胞相容性，以确保眼部应用的安全性。结果表明，材料成分显著影响细胞活力。

尽管生物打印技术的发展仍处于早期阶段，但成功复制天然组织的微观结构和排列以及开发个性化眼科设备在组织恢复方面取得了巨大进展，这令人鼓舞，并有可能应用于其他细胞基系统。

封装细胞治疗及3D打印应用

本节探讨采用封装细胞治疗（ECT）的眼科治疗系统及3D打印的应用。ECT于20世纪60年代提出，此后被应用于全身。ECT涉及使用细胞产生治疗性因子，这些因子被释放到其局部环境中。为防止细胞排斥，植入的细胞被封装在一个半透性屏障内，该屏障允许营养物质和氧气到达细胞，同时保护它们免受免疫攻击。这些细胞可能是同种异体细胞，例如封装胰腺细胞响应局部葡萄糖水平为1型糖尿病患者提供胰岛素。它们也可能是转基因细胞系，用于生产特定的蛋白质治疗剂来治疗疾病。

宏观封装和微观封装都已在ECT中得到评估。宏观封装涉及构建一个工程化装置，内部有一个支持细胞的支架，外部包裹一层免疫保护膜。悬浮在培养基或缓冲液中的细胞被加载到装置中，然后密封。缝合夹可用于在植入过程中固定装置。这为植入提供了结构优势，并且工程化的植入材料可以提供超过十年的 longevity。封装ARPE-19细胞的宏观封装装置已递送可溶性血管内皮生长因子受体、睫状神经营养因子（CNTF）和脑源性神经营养因子（BDNF）。首个ECT于2025年3月获得FDA批准，是一种用于治疗2型黄斑毛细血管扩张的宏观封装装置。

微观封装包括将细胞群固定在聚合物半透膜内。与宏观封装相比，这导致表面积与体积比增加，可能有利于细胞运输。封装在海藻酸钠中的ARPE-19细胞已递送补体受体-2片段与因子H抑制结构域相连的分子（CR2-fH）。封装在藻酸盐-聚-L-赖氨酸-藻酸盐中的鼠成肌细胞已递送血管内皮生长因子可溶性受体-2。封装在复合胶原-藻酸盐支架中的HEK293细胞已递送胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）。此外，分泌可溶性血管内皮生长因子受体的ARPE-19细胞被封装在水凝胶中，可直接注射或用作宏观封装装置的基质。

3D打印已被用于辅助这种基于再生医学的药物递送装置的制造。传统的宏观封装制造涉及组装用于支持细胞支架的细纤维，外部有半透膜和密封胶囊。增材制造的进步可用于增加ECT制造的灵活性并缩短制造时间。

Kojima等人开发了一种3D打印的宏观封装装置用于递送BDNF。该装置旨在放置在巩膜附近，在结膜下、Tenon囊下、球后或球周间隙，并允许经巩膜药物递送。该装置由一个圆柱形储库和一个粘合的盖子组成，内部填充了在胶原包被的聚苯乙烯片上培养的ARPE-19细胞。一个允许营养物质到达细胞并允许BDNF扩散的半透膜位于储库面向巩膜的一侧。选择聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEGDM）作为半透膜，因为它被证明能显著降低IgG渗透性，同时允许40 kDa及以下的更小分子更自由地扩散。装置的盖子和壁使用三乙二醇二甲基丙烯酸酯（TEGDM）制造，并使用PEGDM粘合在一起。对于3D打印，树脂由PEGDM和TEGDM使用光引发剂和光敏剂制成。使用QiDi Tech Shadow 5.5 s打印机以50μm层厚打印树脂。为了实现多材料打印，首先使用TEGDM树脂打印第一层，然后清洗构建板并打印半多孔PEGDM层。完成后，再次清洗构建板并使用TEGDM树脂完成储库。使用3D打印将制造时间缩短了4-5倍，并有可能构建使用传统技术无法构建的复杂ECT装置。

ECT在眼部再生药物递送方面显示出前景。眼睛不仅是体内第一个批准ECT的部位，而且还有许多其他眼部疾病可以使用细胞基治疗递送来治疗。眼睛特别适合ECT，因为它是免疫豁免部位，有安全植入医疗设备的大量先例，并且临床医生能够直接监测植入的设备。ECT有潜力提供长期的药物递送，时间远长于生物可降解或储库型的延长药物递送系统。与当前的基因治疗系统不同，ECT可通过手术移除装置来逆转。此外，ECT可能没有当前基因疗法所见的炎症限制。然而，ECT装置需要手术植入，具有手术风险和植入装置的术后并发症风险。此外，细胞需要能够随时间递送治疗量的药物。3D打印在制造未来ECT方面显示出前景，因为其在制造复杂结构方面具有灵活性，能够将多种材料整合到一个装置中，并且提高了3D打印的吞吐量。

未来方向

细胞治疗和3D生物打印技术在眼科的最新进展在组织工程和再生医学方面显示出巨大潜力。然而，存在一些监管和技术障碍。FDA自2017年起已为3D打印医疗设备建立了指南，然而，针对3D打印治疗系统的全面法规仍然不完善。为了将当前研究从创新推向临床和实际应用，建立强大的质量标准和3D打印治疗系统的评估协议非常重要。一旦监管问题得到解决，细胞治疗、3D生物打印技术及其组合领域可能会增加在临床环境中的适用性，特别是在个性化治疗方法方面。为此，将增强细胞功能，例如开发能够检测生理变化和调节治疗分子分泌的细胞。为了应用这些响应性细胞，需要设计细胞储库包含的植入物以不阻碍细胞功能。此外，从系统角度来看，升级生物打印技术以整合具有诊断和治疗能力的生物材料将是必要的。因此，需要深入和跨学科的努力来探索创新的制造技术以及细胞工程的进步。通过追求这些平行的研究途径，我们可以为开发用于眼科应用的复杂3D生物打印细胞治疗系统铺平道路。