通过降低线粒体钙水平诱导线粒体低毒兴奋效应以增强老年生存能力和运动能力

本综述深入探讨了通过遗传与药理学手段抑制线粒体钙（Ca2+）摄取对衰老的积极影响。研究揭示了降低线粒体钙水平可诱导线粒体低毒兴奋效应（Mitohormesis），通过短暂的活性氧（ROS）升高激活pmk-1（p38 MAPK）、daf-16（FOXO）和skn-1（NRF2）信号通路，从而增强抗氧化防御、维持线粒体结构与功能（如NAD+/NADH比率和耗氧率），最终显著延长秀丽隐杆线虫（C. elegans）寿命并改善其老年运动能力。研究还证实FDA批准的药物米托蒽醌（Mitoxantrone）能模拟此效应，并在人包皮成纤维细胞（HFF-1）中验证了其跨物种相关性，为靶向MCU以促进健康衰老提供了强有力的理论依据和转化前景。

　　

摘要

线粒体钙（Ca²⁺）稳态在衰老和细胞健康中扮演着关键角色。本研究探索了通过遗传和药理学手段抑制线粒体Ca²⁺摄取对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）寿命和健康的影响。研究发现，RNA干扰介导的线粒体钙单向转运体（MCU） ortholog mcu-1的敲低能降低线粒体Ca²⁺水平，从而延长寿命并在衰老过程中保持运动能力，但会损害早期生存。这种寿命益处需要在第14天之前进行干预，并与活性氧（ROS）的短暂增加相吻合，后者激活了涉及pmk-1、daf-16和skn-1的通路，这些分别是人类p38 MAPK、FOXO和NRF2的 orthologs。该通路促进了抗氧化防御机制，并在衰老过程中保持了线粒体结构和功能，维持了更大、更互联的线粒体，并将氧化的/还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺/NADH）比率和耗氧率恢复到年轻水平。使用MCU抑制剂米托蒽醌（Mitoxantrone）进行药理学抑制线粒体Ca²⁺摄取，模拟了mcu-1敲低的效果，延长了寿命并改善了老年线虫的健康状况。在人包皮成纤维细胞中，短期米托蒽醌处理也短暂提高了ROS产生，并诱导了抗氧化防御酶的表达和活性增强，强调了从线虫到人类细胞的研究结果的转化相关性。这些发现表明，调节线粒体Ca²⁺摄取通过ROS介导的信号传导诱导线粒体低毒兴奋效应（mitohormesis），促进线虫的寿命和健康寿命改善，并对人类健康衰老可能具有潜在意义。

1 引言

线粒体钙（Ca²⁺）在调节多种细胞功能中起着核心作用，包括代谢、信号传导以及细胞生存与死亡之间的平衡。因此，线粒体Ca²⁺稳态是一个微妙的平衡。过多或不足的Ca²⁺摄取都可能破坏线粒体功能，导致细胞功能障碍。例如，线粒体Ca²⁺对于增强三羧酸循环（TCA）脱氢酶的活性至关重要，而过多的线粒体Ca²⁺负荷会导致 apoptosis。因此，线粒体Ca²⁺的失调可以显著加速生理衰退，并越来越被认为是衰老和年龄相关疾病（包括神经退行性疾病、心血管疾病和代谢 disorders）的主要贡献者。在衰老过程中，调节线粒体Ca²⁺处理的蛋白质表达和功能变化导致线粒体Ca²⁺稳态失衡，从而引起年龄相关的 deterioration。例如，线粒体Ca²⁺保留能力的下降与年龄相关的肌肉功能损害有关。此外，升高的基础线粒体Ca²⁺水平（可能由于内质网和线粒体之间物理相互作用的增加）与线粒体功能障碍有关，并越来越被认为是细胞衰老的特征和潜在驱动因素。有趣的是，在秀丽隐杆线虫中，增加的线粒体Ca²⁺水平也被证明会导致健康 decline，表明增加的线粒体Ca²⁺水平在老年 organism 中具有有害作用。

衰老相关的线粒体Ca²⁺处理变化不仅影响不同的生物体，还影响各种细胞类型，导致年龄相关的器官 dysfunction。例如，老年神经元中的线粒体Ca²⁺过载与谷氨酸诱导的兴奋性毒性和过多的活性氧（ROS）生成有关，这些事件最终触发 apoptotic 神经元死亡，并 contribute to 疾病如阿尔茨海默病和帕金森病。线粒体Ca²⁺失调也是缺血-再灌注事件中的关键因素，其中线粒体Ca²⁺过载导致线粒体 permeability transition pore 的 opening，触发心肌细胞中的细胞死亡通路和再灌注后的心脏损伤。此外，胰腺β细胞胰岛素分泌依赖于线粒体Ca²⁺摄取，这将葡萄糖代谢与ATP生产联系起来，并触发Ca²⁺依赖的胰岛素 exocytosis，这一过程 strongly affected by 年龄相关的线粒体Ca²⁺稳态变化，可能 serve as a trigger for 代谢疾病如2型糖尿病的发展。

因此，严格控制线粒体Ca²⁺摄取和稳态对于维持完整的细胞功能和预防年龄相关病理至关重要。这种调节主要由一组专门的蛋白质介导，这些蛋白质控制线粒体Ca²⁺进入。外 mitochondrial membrane 主要通过电压依赖性 anion channel 对Ca²⁺ permeable。相比之下，Ca²⁺进入线粒体 matrix 的摄取受到线粒体钙单向转运体（MCU）的严格调节，MCU是位于内 mitochondrial membrane 的高度选择性通道。MCU功能上与 essential MCU regulator（EMRE）相连，后者将其与调节蛋白质 mitochondrial Ca²⁺ uptake 1 and 2（MICU1 and MICU2）连接起来。此外，dominant-negative pore-forming subunit MCUb 和 scaffold factor MCU regulator 1 通过MCU调节线粒体Ca²⁺摄取。值得注意的是，MCU也是一个药理学上可接近的靶点，并且有几种MCU抑制剂可用，包括 ruthenium red 衍生物 Ru265 和米托蒽醌。米托蒽醌已被美国食品药品监督管理局（FDA）和欧洲药品管理局批准用于人类作为抗癌治疗剂， due to its action on DNA topoisomerase II。此外，还有关于该化合物神经保护潜力的报告，这也可能解释其作为减少多发性硬化症复发率和进展的药物的潜在 repurposing。

在秀丽隐杆线虫中，MCU-1对于快速线粒体Ca²⁺摄取和 wounding 后ROS的 generation 是 essential 的。此外，据报道，carbachol 诱导的肌肉刺激导致 mcu-1 缺陷的蠕虫中更小和更短的线粒体Ca²⁺增加。秀丽隐杆线虫中MCU复合物的其他已知成分是 emre-1 和 micu-1。虽然它们的功能仍然 elusive，但 micu-1(null) 突变与 longevity 相关。

线粒体Ca²⁺增强了TCA循环中脱氢酶的活性，并增加了还原当量 NADH 和 flavin adenine dinucleotide 的生产，这些为电子传递链（ETC）提供燃料。虽然这个过程对于 adenosine triphosphate（ATP）生产是 essential 的，但电子通过ETC的转移也产生ROS作为副产物。ROS，如 superoxide 和 hydrogen peroxide（H₂O₂），是反应性分子，如果 not adequately regulated，可以损害蛋白质、脂质、DNA和其他生物分子。因此，ROS必须被线粒体 superoxide dismutase 2（SOD2）和 cytosolic SOD1 解毒，它们将其转化为H₂O₂。然后，这种H₂O₂被 catalase（CAT）或 glutathione peroxidase 进一步处理为水和氧气。此外，还原的 peroxiredoxins 也被 reported to catalyze the reduction of H₂O₂ to H₂O。所有这些人类酶的 orthologs 也在秀丽隐杆线虫中被鉴定出来，并且它们的作用已经在 nematodes 中关于生命和健康跨度相关信号 cascades 方面被广泛研究。在秀丽隐杆线虫中，例如，减少的葡萄糖可用性已被证明触发ROS的暂时增加，这反过来增强了 organism 对氧化应激的抵抗力，并通过线粒体 adaptation 延长寿命，这一现象称为线粒体低毒兴奋效应（mitohormesis），并且不仅限于 nematodes。在小鼠中，胚胎发育期间时间限制的SOD2耗竭与 significant oxidative stress 相关，导致线粒体生物发生和抗氧化基因表达增加，最终在适应的成年动物中导致更低的ROS水平。即使在人类中，运动诱导的氧化应激也被发现改善胰岛素敏感性并刺激 body's own antioxidant defense potential，这些效应在外部抗氧化剂 administered 时被阻断。总的来说，这些发现强调了ROS不仅仅是代谢的有害副产物，而且在不同生物体中也是重要的信号分子。它们激活特定的信号通路和转录因子，上调涉及抗氧化保护的基因。这种适应性反应有助于对抗与衰老相关的 excessive ROS accumulation，这通常由线粒体 dysfunction 驱动，例如ETC中的 defects。

鉴于线粒体Ca²⁺在调节线粒体活性，特别是线粒体呼吸中的核心作用，我们假设线粒体Ca²⁺稳态的 disturbances 可能 critically influence 氧化还原平衡和细胞衰老。因此，本研究旨在调查 targeted inhibition of 线粒体Ca²⁺摄取如何影响ROS稳态和与衰老相关的功能 decline。

2 结果

2.1 降低的线粒体Ca²⁺水平延长寿命并增强运动能力

为了评估线粒体Ca²⁺调节的更广泛 effects，在N2 nematodes 成年第4天启动了RNA干扰（RNAi）介导的 mcu-1 敲低。虽然 mcu-1 RNAi 减少了成年早期的生存，但剩余的 worms 经历了与对照组相比显著的寿命延长。接下来，我们评估了运动能力，以每分钟身体弯曲次数作为健康指标。虽然运动能力随着年龄显著下降，但用 mcu-1 RNAi 处理的N2 nematodes 在成年后期（第21天）表现出显著改善。为了 pinpoint 线粒体Ca²⁺调节最 beneficial 的时间，在特定生命阶段诱导了 mcu-1 敲低。在第14天之前启动的RNAi处理显著延长了寿命，而在第14天之后应用 mcu-1 RNAi 未观察到寿命延长。这些结果表明，成年早期是获得减少线粒体Ca²⁺摄取有益效应的关键时期。为了验证 mcu-1 敲低后线粒体Ca²⁺水平降低，我们在第7、14和21天在用对照RNAi或针对 mcu-1 的RNAi处理的线虫 strain AQ3055 中进行了活细胞成像。该 strain 在咽部肌肉组织中表达线粒体靶向的Ca²⁺生物传感器 YC3.60，这是一种基于 F?rster resonance energy transfer（FRET）的传感器，由 cyan fluorescent protein（CFP）和 yellow fluorescent protein（YFP）组成。我们测定了基础线粒体Ca²⁺水平和用咖啡因 [15 mM] 刺激后的线粒体Ca²⁺摄取。活细胞成像显示，从第7天到第14天和第21天，基础线粒体Ca²⁺水平统计上增加。此外，通过 mcu-1 敲低，在第7、14和21天，基础线粒体Ca²⁺水平显著降低。此外，咖啡因诱导的线粒体Ca²⁺摄取在用 mcu-1 RNAi 处理的 nematodes 中倾向于减少。定量实时PCR（qRT-PCR）证实，RNAi诱导的 mcu-1 敲低导致在第7、14和21天 mRNA 表达水平显著降低。

总之，这些发现表明，通过RNAi介导的 mcu-1 敲低减少线粒体Ca²⁺水平延长了寿命并增强了老年 nematodes 的运动能力，尽管它可能损害成年早期的生存。

2.2 降低的线粒体Ca²⁺水平损害TCA循环和ETC活性，导致短暂的ROS上升

由于线粒体Ca²⁺对于TCA循环脱氢酶的活性至关重要，我们评估了 pyruvate dehydrogenase（PDH）和ETC复合物的活性。响应 mcu-1 RNAi 处理，我们发现PDH活性显著降低。顺序底物和抑制剂 titrations 进一步揭示了复合物I、II和III的活性显著降低，以及最大呼吸减少。ETC功能的此类 impairments 可以促进电子泄漏和 elevated ROS production。因此，我们进行了 Amplex Red 测定。H₂O₂ 水平在N2 nematodes 中从第7天到第21天逐渐增加。值得注意的是，mcu-1 RNAi 处理导致第14天H₂O₂显著上升，随后在后期生命（第21天）与对照组相比水平降低。为了进一步研究 cytosolic H₂O₂ 水平的变化，在第14天用对照RNAi或针对 mcu-1 的RNAi处理的JV1 strain 中进行了活细胞成像。该 strain 在核糖体 promoter 下表达H₂O₂传感器 HyPer，并在455 nm和505 nm激发，而激发在500和521 nm之间获取。该 strain 用于评估基础 cytosolic H₂O₂ 水平和在对照条件或 mcu-1 敲低下第14天活 nematodes 中应用H₂O₂后的响应。这种方法 confirmed 第14天 cytosolic H₂O₂ 水平的短暂增加。因此，我们进一步调查了H₂O₂水平的变化是否与 mcu-1 RNAi 诱导的寿命延长相关。用1 mM ROS清除剂 N-acetyl cysteine（NAC）处理 abolished 了 mcu-1 RNAi 在N2 nematodes 中的寿命延长 effects，线粒体特异性抗氧化剂 MitoTEMPO [100 nM] 也是如此。这些结果表明，ROS水平的短暂增加可能触发一个信号 cascade，促进 longevity 并改善老年 worms 的健康状况。

2.3 降低的线粒体Ca²⁺水平通过ROS激活的信号通路诱导寿命延长

为了调查由 mcu-1 敲低引起的寿命延长是否依赖于ROS敏感的信号通路，我们测试了缺乏 pmk-1、daf-16 和 skn-1 的 worms，这些分别是人类 p38 MAPK、FOXO 和 NRF2 的 nematode orthologs。在 pmk-1 缺陷的 worms 中，mcu-1 RNAi 未能延长寿命，在缺乏 daf-16 和 skn-1 的 worms 中也是如此。值得注意的是，缺乏 AMP-activated protein kinase（AMPK）（aak-2）或 sirtuins（sir-2.1）不能阻止 mcu-1 RNAi 诱导的寿命延长，表明该效应是由 transient ROS fluctuations 触发的信号 cascade 介导的，而不是由营养感应通路介导的。由于DAF-16和SKN-1促进抗氧化防御机制，我们还测试了缺乏 superoxide dismutase（sod-2）的 worms。相应实验的结果表明，在 sod-2 缺陷的 worms 中，mcu-1 RNAi 的寿命延长和健康增强 effects 都被 abolished，这些 worms 没有表现出在N2 nematodes 中 aging 或响应 mcu-1 RNAi 在第14天特征性的H₂O₂上升。接下来，使用JV2 strain 来评估氧化与还原 glutathione（GSSG/GSH）水平的基础比率，在具有和不具有 mcu-1 敲低的 nematodes 中应用H₂O₂之前和之后。在衰老过程中，JV2 nematodes 中的GSSG/GSH比率增加。值得注意的是，在用 mcu-1 RNAi 处理的 nematodes 中，GSSG水平在中年期间增加，而在处理的 worms 中老年时期观察到 reduced GSSG/GSH 比率。并行地，我们检查了两个已建立的DNA损伤标志物的表达， programmed cell death activator egl-1 和 cell death protein 3 subunit p17（ced-3），这些在 aging 时倾向于上调，但在用 mcu-1 RNAi 处理的 worms 中第21天显著下调，支持了涉及FOXO和NRF2的ROS诱导信号通路对抗年龄相关 genotoxic stress 的观点。

总之，这些结果表明，通过线粒体Ca²⁺调节的ROS稳态转变，涉及 pmk-1、daf-16 和 skn-1，导致增强的抗氧化防御机制和 mcu-1 RNAi 处理后的寿命延长。

2.4 降低的线粒体Ca²⁺水平在老年 nematodes 中正常化线粒体结构和功能

接下来，我们利用W118 strain 来测试肌肉特异性 mcu-1 敲低是否足以延长寿命。实际上，在该 strain 中，整体寿命被 mcu-1 RNAi 显著增加，而在具有肠道特异性 mcu-1 敲低的VP303 strain 中未发现寿命延长。由于肌肉功能强烈依赖于线粒体功能，并且NRF2激活与增加的线粒体生物发生有关，我们还通过共聚焦显微镜调查了衰老过程中和响应 mcu-1 RNAi 的线粒体结构，在新开发的 worm strain MIR151 中，该 strain 在线粒体 matrix 中在 sur-5 promotor 下表达 mCherry。线粒体体积和表面积下降，而体积加权 compactness 和体积加权 sphericity 在衰老过程中增加，表明向更小、更球形线粒体的转变，与衰老过程中进行性线粒体 fragmentation 一致。mcu-1 敲低减轻了这些年龄相关的变化，到第21天恢复了正常的线粒体形态。值得注意的是，mcu-1 RNAi 处理减轻了这些年龄相关的结构变化，在第14天和第21天保持了更大和更互联的线粒体。在功能上，用 mcu-1 RNAi 处理的N2 worms 在第21天显示出改善的NAD⁺/NADH比率。此外，mcu-1 RNAi 导致N2 nematodes 在第21天基础耗氧率（OCR）增加， counteracting 了年龄相关的OCR减少。

这些数据表明，减少的线粒体Ca²⁺摄取不仅保留了线粒体结构，而且增强了成年后期的线粒体功能。

2.5 MCU复合物的药理学抑制在线虫中模拟 MCU-1 敲低

鉴于FDA批准使用MCU抑制剂米托蒽醌用于人类，我们使用该化合物来测试低剂量的米托蒽醌是否可以复制 mcu-1 RNAi 的效果。用10 nM米托蒽醌处理显著减少了中年时期的寿命（第12-14天），但延长了存活的N2 worms 的寿命，并改善了老年 nematodes 在第21天的运动能力，类似于 mcu-1 RNAi 观察到的 effects。像 mcu-1 RNAi 一样，米托蒽醌在第14天之前给药显著延长了N2 nematodes 的寿命，但在第14天之后应用无效。至于 mcu-1 敲低 worms，用DMSO或米托蒽醌处理的MIR151 strain 的共聚焦显微镜显示，米托蒽醌增加了线粒体体积和表面积，同时减少了体积加权 compactness 和体积加权 sphericity，表明向更 elongated 和 less spherical 线粒体形态的转变。

这些发现表明，FDA批准的药物米托蒽醌，在低剂量下，可能模拟 mcu-1 RNAi 的效果。

2.6 降低的线粒体Ca²⁺摄取在HFF-1细胞中诱导短暂的氧化应激和抗氧化适应

为了评估我们从 nematodes 到哺乳动物细胞的发现的 translatability，我们测量了在短期（3小时）用低剂量 [100 nM] 米托蒽醌处理后HFF-1细胞中的细胞器 Ca²⁺ 和 H₂O₂ 水平。表达线粒体Ca²⁺传感器 mtD1GO 的HFF-1细胞的活细胞成像 demonstrated 显著降低的基础线粒体Ca²⁺水平和响应100 μM组胺的减少的线粒体Ca²⁺摄取 after 3小时米托蒽醌处理。如在线虫中，HFF-1细胞中减少的线粒体Ca²⁺摄取伴随着复合物I、II和III以及复合物IV活性的显著降低。利用线粒体 Hyper7 传感器的活细胞成像也揭示了在3小时米托蒽醌 [100 nM] 处理后HFF-1细胞中线粒体 H₂O₂ 水平增加。类似于在线虫中的发现，米托蒽醌处理诱导了细胞存活的短暂下降，在3小时用100 nM米托蒽醌处理后24小时观察到 viability 显著降低。增殖分析显示，尽管许多细胞由于米托蒽醌处理经历了 sustained growth arrest，但一个子集继续分裂。这种 heterogeneous 响应可能反映了有限的 adaptive capacity，使得在更 resistant 细胞 fraction 内 survival 和 partial regrowth 成为可能。由于线粒体低毒兴奋效应响应通常以 transient stress 后增强的抗氧化防御为特征，我们接下来评估了暴露于米托蒽醌后关键抗氧化酶的表达和活性。值得注意的是，SOD2、SOD1和CAT的mRNA水平在24小时显著升高，并在处理后48小时进一步增加。一致地，SODs的酶活性仅在48小时显著升高，而CAT活性早在24小时就增加，并在48小时保持升高。

这些发现表明，受损的线粒体Ca²⁺摄取触发ROS水平的短暂上升，随后是 characterized by upregulation of the cellular antioxidant defense system 的适应性响应。因此，靶向线粒体Ca²⁺摄取可能代表一个有前途的治疗策略，以增强健康和寿命。

3 讨论

我们的发现表明，通过 mcu-1 RNAi 适度减少线粒体Ca²⁺摄取延长了老年 nematodes 的寿命并增强了运动能力，尽管损害了成年早期的生存。这种寿命延长与线粒体 H₂O₂ 水平的短暂增加有关，后者启动了一个涉及 pmk-1（p38 MAPK）、daf-16（FOXO）和 skn-1（NRF2）的信号 cascade。该通路增强了抗氧化防御，减轻了氧化应激，并在衰老过程中保留了线粒体完整性。重要的是，用米托蒽醌药理学抑制线粒体Ca²⁺摄取模拟了 mcu-1 RNAi 在线虫和人类HFF-1细胞中的有益 effects，进一步证明了靶向线粒体Ca²⁺调节在衰老和可能年龄相关疾病中的治疗潜力。

先前的一项研究使用 mcu-1(ju1154) mutant strain 证明，稳定的 mcu-1 缺陷延长寿命并增强运动能力直到第13天。该报告表明，抑制MCU-1功能通过减轻年龄相关的线粒体Ca²⁺积累和随后的 mitophagy 激活来保持肌肉健康。虽然我们的实验 confirmed 了年龄相关的线粒体Ca²⁺增加，甚至直到第21天，但我们观察到 mcu-1 RNAi 在线虫寿命期间的 biphasic 响应，中年时期生存减少和寿命延长，伴随着老年时期运动能力增加。值得注意的是，我们发现 hampering 线粒体Ca²⁺摄取直到第14天足以 provoke longevity，而仅在老年启动的 mcu-1 RNAi 处理未能延长寿命。这些结果强调了在中年由 transient mcu-1 敲低激活的 adaptational mechanisms 在驱动 longevity 中的重要性。先前使用的 mcu-1(ju1154) mutant 可能已经获得了这些与ROS防御相关的机制 due to long-term adaptations，这可能 contributed to 中年时期增强的运动能力。

我们的数据还 revealed，线粒体Ca²⁺摄取与 pyruvate dehydrogenase（PDH）和ETC活性的减少有关，后者是ROS生产的关键 site。为了在这些测定中获得分离线粒体所需的大量 nematodes，我们从平板培养切换到液体培养。我们承认液体培养条件可能引入生理差异。因此，所有比较都是针对在相同液体培养条件下生长的对照样品进行的，以准确评估受损线粒体Ca²⁺摄取的效果。

虽然由于缺乏适当的方法，线粒体Ca²⁺摄取抑制诱导的ROS的确切种类仍然 elusive，但通过 Amplex Red 测定和活细胞成像发现，用 mcu-1 RNAi 处理的 middle-aged worms 中H₂O₂短暂上升。全局ROS清除剂NAC和线粒体特异性抗氧化剂MitoTEMPO阻止 mcu-1 RNAi 诱导的寿命延长 further highlighted ROS在由线粒体Ca²⁺摄取抑制引起的寿命延长中的关键作用。值得注意的是，NAC和MitoTEMPO清除不同类型的ROS。虽然NAC主要清除H₂O₂和羟基自由基，但MitoTEMPO特异性清除线粒体超氧阴离子。因此，这些发现表明，多种类型的ROS可能 contribute to 由线粒体Ca²⁺摄取抑制诱导的寿命延长。鉴于H₂O₂是 p38 MAPK