基质金属蛋白酶抑制可挽救端粒酶缺陷斑马鱼衰老模型的肌肉再生能力

本研究发现端粒酶缺陷（tert突变）斑马鱼作为加速衰老模型，其肌肉干细胞（muSC）在损伤后表现出迁移障碍、激活受损和增殖受限。研究证实衰老样炎症环境通过持续性巨噬细胞浸润和 elevated matrix metalloproteinase (MMP) 活性阻碍再生进程。采用MMP9/13抑制剂干预和巨噬细胞基因剔除可部分恢复muSC迁移行为与再生效果。该研究首次揭示muSC迁移动力学与再生成功的功能性关联，为衰老相关肌肉再生障碍提供了新的治疗靶点和筛选平台。

　　

引言：肌肉再生与衰老的挑战

骨骼肌再生能力随年龄增长显著下降，导致修复功能受损和进行性肌肉质量损失。这种再生衰竭既源于肌肉干细胞（muSC）内在功能障碍，也来自组织微环境的外在变化。年轻肌肉中，损伤会触发muSC激活、增殖并分化为新肌纤维的协调反应，而免疫细胞通过瞬时炎症信号促进修复。然而衰老打破了这种平衡，老年muSC表现出增殖能力下降和衰老易感性增加，这由p38 MAPK信号等应激通路的慢性激活驱动。虽然p38 MAPK活性在正常条件下对muSC分化至关重要，但其在老年组织中的持续激活通过过早限制muSC增殖和自我更新而导致再生受损。这种细胞内在恶化与老年肌肉生态位的变化相结合，其中慢性低度炎症（"炎症衰老"）导致 prolonged exposure to inflammatory cytokines such as IL-6 and TNFα。核因子κB（NF-κB）信号通路的过度激活，作为促炎通路的关键转录调节因子，也在包括肌肉减少症在内的各种年龄相关疾病中 implicated。

tert突变斑马鱼：加速衰老模型

为研究衰老如何影响muSC功能，研究团队评估了端粒酶缺陷（tert突变）斑马鱼（Danio rerio）的muSC功能。tert突变斑马鱼是早衰模型，表现为肌肉萎缩、慢性炎症和再生能力受损。端粒酶突变动物近交产生的F2幼鱼表现出增加的细胞衰老、 elevated apoptosis 和组织退化，表明加速衰老表型。虽然tert突变体并未表现出衰老哺乳动物的所有系统代谢和内分泌变化，但它们表现出类似的持续性炎症状态和p53信号升高。

分子与功能变化特征

为理解端粒酶功能丧失如何影响斑马鱼肌肉，研究通过RNA测序（RNA-seq）分析了5天受精后（5 dpf）tert幼鱼肌肉组织的基因表达变化。差异基因表达和基因本体（GO）分析显示与炎症、基质组织、细胞应激和蛋白质稳态相关的基因发生显著变化。突出的炎症标志物如mmp9、cxcl18b和tnfrsf1a上调，表明炎症状态升高。组织学检查显示tert突变体和野生型（WT）幼鱼的肌肉组织没有明显形态学差异，两组的肌纤维结构完整且排列良好。然而，通过突触前标志物SV2和突触后乙酰胆碱受体（AChR，用α-银环蛇毒素标记）的免疫荧光染色评估，tert突变体的神经肌肉接头（NMJ）完整性受损， individual presynaptic and postsynaptic puncta 和它们之间的共定位减少。此外，通过BrdU掺入实验观察到muSC增殖减少，表明tert突变幼鱼的再生潜力受损。

再生过程中的muSC行为异常

鉴于muSC迁移对肌肉再生的关键作用，研究询问tert突变体中muSC对损伤反应能力的变化是否与迁移行为改变相对应。使用表达pax7a:egfp转基因的幼鱼进行活体成像，在tert突变体和WT幼鱼中从6 hpi到24 hpi跟踪了muSC运动。muSC定位和运动的量化揭示了WT和tert突变体幼鱼之间的显著差异。在WT幼鱼中，muSC有效迁移到损伤部位并逐渐积累，到24 hpi时与损伤部位的相邻纤维对齐。相反，tert突变体中的muSC表现出减少和受限的迁移，随时间推移损伤部位存在的细胞更少。细胞运动和细胞形状的进一步详细分析显示，虽然平均细胞速度增加，但muSC从其起源点移动的距离显著 shorter，并且显示出更大的圆形度，表明快速但受限的运动。使用多元线性回归模型测试均方位移（MSD）是否显示tert突变体和WT之间的显著差异。tert突变体的MSD显著低于WT动物，表明细胞迁移受损。

持续性炎症与巨噬细胞清除延迟

为理解tert突变体是否表现出影响muSC反应的损伤反应改变，研究在针状损伤后24小时对5 dpf幼鱼的受伤肌肉组织进行了RNA-seq。KEGG通路分析显示，与WT幼鱼相比，tert突变体中炎症通路显著上调，特别是那些与ECM重塑和免疫反应相关的通路。其中，发现受伤tert突变体肌肉中MMP基因与受伤WT相比强烈上调。使用qPCR和HCR，证实受伤后tert突变体肌肉中mmp9和mmp13表达升高。鉴于tert突变体再生肌肉显示出强烈的炎症特征，可能 perturb immune cell function，研究检查了巨噬细胞对损伤的反应。在WT幼鱼中，巨噬细胞在24 hpi前已离开损伤部位，而在tert突变体中，巨噬细胞持续存在于损伤部位。巨噬细胞的量化显示在8 hpi和24 hpi时tert突变体中的数量显著更高，表明tert突变体对损伤的炎症反应 prolonged 和 resolution failure。

MMP抑制的拯救效应

金属蛋白酶是组织重塑的主要调节因子，在肌肉损伤期间由巨噬细胞表达。与WT肌肉相比，受伤tert突变体肌肉中mmp9和mmp13均显著上调，表明它们可能对受损的muSC反应很重要。因此，研究测试了MMP抑制如何影响muSC对损伤的反应，方法是用MMP9/13抑制剂I处理tert突变体和WT幼鱼24小时，随后损伤后处理，然后检查muSC反应。相对于未处理的tert突变体，tert突变体中Pax7+ muSC的数量显著增加，达到与WT对照相当的水平。类似地，表达pax7a:egfp的muSC的增殖在抑制剂处理的tert突变体中也比未处理的tert突变体显著改善。这些结果表明过度的MMP9/13活性损害muSC激活和增殖，其抑制可挽救这些早期再生反应。为评估干细胞功能的这种改善是否转化为改善的肌肉再生，量化了96 hpi时的多核肌纤维。抑制剂处理的tert突变体幼鱼表现出多核纤维数量显著增加，表明融合增强和再生改善。使用鬼笔环肽在6 dpi检查肌纤维形态显示，新再生纤维的排列与WT幼鱼中看到的相似。再生肌肉中NMJ形成的进一步表征显示，与未处理的对照tert突变体相比，抑制剂处理的tert突变体损伤部位突触前和突触后 puncta 数量增加。抑制剂处理的tert突变体中共定位 puncta 的数量与再生WT幼鱼中看到的相当。

巨噬细胞剔除的部分挽救作用

为理解巨噬细胞存在是否直接影响老化样背景下的muSC行为和增殖，利用甲硝唑-硝基还原酶（MTZ-NTR）系统在巨噬细胞特异性启动子fms（csfr1a）控制下进行巨噬细胞剔除。通过荧光显微镜确认成功的巨噬细胞剔除。巨噬细胞剔除后，观察到Pax7阳性muSC数量的显著恢复和muSC的BrdU掺入增加，表明tert突变体中muSC的激活和增殖改善。然而，6 dpi的分析显示巨噬细胞剔除后tert突变体中肌纤维组织存在持续异常。为进一步评估再生过程，量化了96 hpi时的肌纤维。抑制剂处理的tert突变体幼鱼表现出多核纤维数量略有增加，但与DMSO处理的WT幼鱼不相称，与观察到的持续异常一致。为确定神经再支配是否被挽救，量化了再生肌肉中的NMJ形成。在缺乏巨噬细胞的tert突变体损伤部位检测到增加的共定位突触前和突触后 puncta，但这与WT幼鱼不相称。这表明去除巨噬细胞并未完全挽救tert突变体的肌肉再生。

细胞迁移动力学的改变

为确定巨噬细胞剔除如何影响再生过程中的muSC迁移动力学，可视化表达pax7a:egfp的muSC。发现与未处理的tert突变体相比，巨噬细胞切除后tert突变体损伤部位更早和更 robust 的muSC积累。这反映了定位在损伤区域内的muSC比例增加，表明在没有巨噬细胞的情况下muSC的招募更快。迁移特征的进一步分析显示，巨噬细胞切除部分挽救了muSC迁移行为的几个方面。处理的tert突变体中的muSC显示出从起源点移动距离的显著增加和细胞圆形度的减少，反映了更有效和定向的运动。相对于对照突变体，MTZ处理的tert突变体的平均细胞速度降低，并且虽然均方位移（MSD）与对照突变体相比显著不同，但也与野生型动物不同。

讨论与展望

本研究揭示老化样环境在tert突变体中对肌肉再生 refractory，伴随受损的muSC激活和迁移动力学。这是由巨噬细胞分泌的金属蛋白酶的不适当活性介导的，这些蛋白酶抑制muSC迁移和新肌纤维的生成。通过部署活体成像，证明muSC对损伤反应的动力学可以与其修复肌肉的功能能力相关联，将细胞行为与再生结果联系起来。这些发现强调了慢性和ECM变化对体内muSC功能的影响，为老化中肌肉再生受损的基础提供了新的见解。端粒酶缺陷斑马鱼 rapidly develop an ageing-like phenotype，使其成为研究组织环境中的年龄相关变化如何影响再生的强大模型。tert突变体中的端粒缩短 triggers increased cellular senescence and chronic, systemic inflammation。虽然tert突变体并未完全重现哺乳动物或自然老化斑马鱼肌肉老化的整个 spectrum，但它们提供了一个可处理的模型来 interrogate 来自端粒功能障碍的特定老化样应激源。本研究侧重于这些应激源，包括慢性炎症和ECM重塑，如何影响再生过程中的肌肉干细胞行为。尽管幼鱼和成鱼之间存在发育差异，特别是在免疫系统成熟方面，但巨噬细胞介导修复的核心特征——如招募、碎片清除和促再生极化——在斑马鱼的生命阶段中得以保留。此外，观察到巨噬细胞积累和改变的迁移模式，反映了成体组织损伤模型中看到的那些。