基于核碱基修饰的适体酶促截断、标记与突变通用策略及其在吲哚修饰β-伴大豆球蛋白适体中的应用

本综述系统介绍了一种创新的酶学方法，用于实现核碱基修饰适体（aptamer）的精准截断（truncation）、功能标记（labeling）和位点特异性突变（mutation）。该方法基于含核糖核苷酸（ribonucleotide）引物的延伸反应，通过RNase特异性切割实现5′端或双端截断，突破了传统化学合成法的限制。利用双重标记引物，可高效引入荧光（如Cy5）或生物素（biotin）等修饰，适用于荧光检测（fluorescence-based assays）和固相 immobilization 分析。该技术为（超）修饰功能寡核苷酸（hypermodified oligonucleotides）的制备提供了高效、灵活的酶学合成方案，显著推动了修饰适体在分子识别与生物传感领域的应用。

　　

引言

天然核酸不仅是遗传信息的载体，更是具有调控、配体结合和催化功能的多功能生物大分子。适体（aptamer）作为通过指数富集配体系统进化技术（SELEX）从寡核苷酸库中筛选出的单链序列，能够折叠成特定二级结构，以高亲和力和特异性结合靶标分子。与抗体相比，适体具有化学合成可控、批次间差异小、易于规模化生产等优势，已被广泛应用于临床诊断和食品安全检测领域。

核碱基修饰适体通过引入非经典碱基，扩展了适体的化学多样性。芳香族和疏水性基团（如吲哚）的引入可模拟抗体中的氨基酸侧链，通过形成额外的疏水作用、π–π堆积或氢键增强分子识别能力。例如，Gold等人开发的慢解离速率修饰适体（SOMAmers）通过疏水修饰显著提高了结合亲和力和稳定性。

适体优化过程中的关键环节是序列长度的调整。典型适体长度为40–100个核苷酸，但并非所有区域均参与靶标识别。截除非必需核苷酸（如原始库中的引物结合序列）可提高结合亲和力、特异性，并降低生产成本。然而，过度截断可能破坏其二级结构，导致功能丧失。

对于未修饰适体，截断突变体的构建可通过商业化学合成实现。但多数核碱基修饰核苷酸无法商业获得，需通过化学或酶学法引入。尽管聚合酶链式反应（PCR）可用于生产修饰适体候选物，但其仅允许从3′端进行截断，且无法实现多修饰dNTPs的指数扩增，限制了超修饰适体的制备。其他酶学方法（如NEAR）或核酸外切酶作图法也存在一定局限性。近期发展的基于逆转录（RT）的方法使用含核糖核苷酸的引物和RNase AT1切割，可实现未修饰引物区域的去除，为修饰适体的酶促截断提供了新思路。

结果与讨论

本研究以新筛选的吲哚修饰β-伴大豆球蛋白适体为模型，开发了一种通用的酶促截断、标记和突变方法。β-伴大豆球蛋白是白羽扇豆中的主要过敏原，可引发过敏反应，其高灵敏度检测对食品安全至关重要。此前研究的未修饰适体虽已应用于等温扩增检测和侧流层析试纸条，但其性能仍有提升空间。

通过SELEX技术，从含50个随机位置的ssDNA库中筛选出吲哚修饰适体HB8（K_D?=?0.6?nM）。该适体采用5′-磷酸化反向引物和吲哚修饰的dA^EInTP进行PCR扩增，并经λ-核酸外切酶消化获得单链库。经过12轮筛选，通过NGS分析结合序列的富集情况，最终获得8个候选适体。经ELAA、SPR、MST和BLI等多种技术验证，HB8表现出高亲和力和特异性。

新开发的酶学方法基于引物延伸（PEX）反应，采用含核糖核苷酸（rN）的引物和生物素化DNA模板。通过链霉亲和素磁珠分离模板，RNase AT1（含RNase A和RNase T1）特异性切割rC/rU或rG位点，实现引物区域的去除。为获得5′端标记的截断适体，采用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）和dC^Cy5TP对引物进行荧光标记，从而在核糖核苷酸后方引入荧光基团。

该方法成功合成了从3′端（HB8_T1）、5′端（HB8_T2）或双端（HB8_T3）截断的适体变体（表1）。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和LC-MS对产物进行表征。此外，通过调整引物长度，还合成了部分突变体（如HB8_M1和HB8_M2），用于研究修饰位点的重要性。

通过MST测量各截断和突变体的结合亲和力（图1）。3′端截断的HB8_T1（K_D?=?42?nM）与全长HB8（41?nM）亲和力相当，表明3′端21核苷酸区域不参与靶标结合。将该区域的吲哚修饰核苷酸替换为天然碱基（HB8_M2）也未显著影响亲和力（44?nM）。然而，将中心区域的三个吲哚修饰碱基替换为天然碱基（HB8_M1）则导致亲和力下降（K_D?=?134?nM）。5′端截断（HB8_T2）或双端截断（HB8_T3）的亲和力均有所降低（256?nM和145?nM），表明5′端区域对二级结构形成至关重要。值得注意的是，仅截除5′端10个核苷酸的HB8_T4表现出更高的亲和力（K_D?=?24?nM），提示该区域可能引起空间位阻或非生产性二级结构。

为实现适体在BLI或SPR中的固定，开发了5′端生物素化策略。采用含两个核糖核苷酸的引物和dC^BioTP进行TdT标记，使用5′-磷酸化模板并在PEX后通过λ-核酸外切酶和RNase AT1同步消化，最终通过离心柱纯化获得高纯度5′端生物素化适体。

在应用方面，HB8和HB8_T1在竞争性ELAA中检测限（LOD）分别为166?pM和118?pM，优于此前报道的未修饰β-BCA-II适体（273?pM）。基于吲哚修饰适体倾向于结合β-伴大豆球蛋白疏水区域，而未修饰适体（如β-CBA-I、SGQ和β-CBA-II）结合亲水表位的特性，成功开发了板式三明治检测法（图2）。将未修饰适体固定于马来酰亚胺功能化板上，捕获β-伴大豆球蛋白后，加入吲哚修饰适体作为报告分子。结果显示，HB8和HB8_T1均能形成特异性三明治结构，而与对照蛋白（麦胶蛋白）无显著结合，证实了修饰与非修饰适体可同时结合不同表位。

结论

本研究开发了一种通用、高效的酶学方法，用于合成截断和标记的修饰适体。以吲哚修饰β-伴大豆球蛋白适体为模型，通过SELEX获得高亲和力适体，并在此基础上建立了灵敏的三明治检测法。基于PEX反应、模板磁分离和RNase切割的截断策略，可实现5′端截断、标记和突变体的制备。该方法不仅适用于碱基修饰，理论上也可拓展至糖修饰（如TNA、LNA、2′-氟或2′-O-烷基修饰）的XNA合成。尽管化学合成在规模化生产已优化适体方面仍具优势，但本酶学方法为早期适体优化提供了高效、灵活的替代方案，避免了化学合成的繁琐与局限性。