Eperua oleifera Ducke油树脂化学成分解析与新型天然二萜酸甲酯的首次发现及其在天然产物研究中的意义

本研究深入解析了Eperua oleifera Ducke油树脂的化学成分，通过GC–MS和UHPLC–HRMS技术鉴定出12种二萜类化合物（包括9种羧酸和3种醇），其中硬脂酸（hardwickiic acid）和柯巴酸（copalic acid）为主要成分。首次从天然油树脂中分离并通过NMR确证了硬脂酸甲酯的存在，该发现打破了油树脂仅含游离酸的传统认知，为天然产物研究和药物开发提供了新的化学实体和方向。

　　

引言

油树脂是植物分泌的特殊渗出物，由多种萜类天然产物组成，仅含萜类成分，通常由挥发性单萜和倍半萜溶解树脂状的重质二萜和三萜构成。例如，松树（Pinus）油树脂由芳香二萜酸和单萜组成；乳香（Olibanum）和没药（Boswellia）以及Burseraceae科的Protium属油树脂则由单萜和主要属于羽扇豆烷和乌苏烷骨架的三萜组成；而Copaifera油树脂（或copaiba油）由挥发性倍半萜和树脂状二萜构成。它们以独特方式产生并储存在树干内的大通道中，无需溶剂或压力提取，仅通过过滤即可获得纯油树脂。

在亚马逊地区，油树脂主要来自Protium（Burseraceae）、Copaifera和Eperua（Fabaceae）属。这些油树脂在传统医学中广泛用于伤口愈合、抗炎、镇痛和治疗溃疡。此外，Protium物种（通常称为Breu Branco）传统上用作天然驱虫剂、填缝剂和香料固定剂。Copaiba油用于化妆品行业生产肥皂、香水、洗发水、护发素，并作为可再生燃料来源。然而，由于形态相似性，物种误识别是药用植物商业化中的主要问题之一，不同物种常以相同或相似名称出售。例如，Eperua oleifera通常被称为copaíba-jacaré，其名称类似于黄色copaiba油，但颜色为鳄鱼色（绿色至深色树脂）。

Eperua Aublet是豆科（Fabaceae）的一个属，在分类上与Copaifera非常相似，目前描述了14个物种，主要分布在亚马逊地区至中美洲，树木高度可达70米。Eperua物种产生的油树脂与Copaifera非常相似。化学上，Eperua油树脂主要由具有克罗烷（clerodane）和半日花烷（labdane）骨架的二萜组成，与Copaifera中的二萜非常相似，主要是单和二元羧酸，有时是少量醇类。然而，Eperua油树脂在已知油树脂中独一无二，因为它仅含二萜，导致材料更加粘稠。植物化学研究描述了Eperua purpurea和Eperua leucantha的油树脂，它们具有高度化学相似性，主要由二萜酸和少量醇组成。这些物种中鉴定的主要二萜属于半日花烷型结构类别，包括柯巴酸（copalic acid）、cativic acid、eperuic acid和8(17)-labden-15-yl 8(17)-labden-15-oate。此外，一项使用E. oleifera Ducke油树脂针对肿瘤细胞系的细胞毒性研究确定柯巴酸和硬脂酸为主要成分。然而，尽管具有药理潜力，针对E. oleifera的生物活性与其化学成分关系的研究很少。在本研究中，采用了多种分析策略来表征采集自亚马逊地区的E. oleifera Ducke油树脂。样品经过化学衍生后通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）进行分析，使用了我们研究小组先前分离的几种标准品。最终，分离出一种天然存在的甲酯，并通过核磁共振（NMR）光谱确认了其结构，这一发现具有重要意义，因为酯类此前未在油树脂中报道过。

结果与讨论

植物化学分析

衍生化粗油的GC分析揭示了30种化合物的存在。这些化合物使用美国国家标准与技术研究院（NIST）参考库和文献数据基于先前表征化合物的MS裂解模式进行鉴定。在这30种化合物中，12种与NIST数据库的匹配度超过90%，并通过文献参考进一步确认。检测到的化合物属于萜类，主要是二萜酸，这些酸先前在copaiba油树脂和其他Eperua物种中有过描述。这一发现支持了E. oleifera油树脂与Copaifera油树脂类似药用目的的传统治疗用途。确实，天然产物研究中常用的气相色谱系统通常使用低苯基含量的甲基硅酮作为固定内相，例如DB-5或SE-5，这些对羧酸的分辨率不佳。因此，将这些基团衍生化为极性较小、分辨率更好的甲酯始终是最先进的方法。因此，检测到的物质包括羧酸（以其相应的甲酯形式识别）和醇类。

柯巴酸和硬脂酸（以其甲酯形式检测到）是主要成分，相对丰度分别为16.0%和62.8%。这些化合物通过其特征裂解模式和基峰值确认：甲基柯巴酯的m/z 114和甲基硬脂酯的m/z 139。柯巴酸在文献中被广泛报道，特别是作为所有copaiba油树脂中唯一一致存在的二萜。因此，多项药理学研究记录了其抗炎、抗菌、抗真菌、抗寄生虫和针对肿瘤细胞系的细胞毒性活性。与柯巴酸类似，硬脂酸也具有药理特性，如抗炎、抗菌、抗寄生虫、抗真菌和抗肿瘤活性。然而，尽管在众多植物化学研究中有报道，但由于其在天然来源中的浓度较低，分离硬脂酸的生物学评价仍然具有挑战性。

Eperuic酸，因其首次在Eperua物种中描述而得名，也基于衍生化化合物的裂解模式被识别。此外，其他二萜酸，包括14,15,16-三去甲硬脂酸和2-氧代柯巴烯酸（先前在E. leucantha的种子中报道为成分），以及cleroda-7,13E-dien-15-oic酸（在E. purpurea中描述）也被识别。检测到的另一类二萜包括醇类labd-8(17),13E-dien-15-ol和labd-8(20)-en-15-ol，两者均为E. purpurea的化学成分。此外，还识别了先前未在Eperua物种中报道的其他二萜，遵循Copaifera物种的植物化学数据。这些包括柯巴烯酸（kolavenic acid）、clerod-3-en-15,18-dioic acid和巴塔哥尼亚酸（patagonic acid）。Kolavelool先前在Hardwickia pinnata物种中被表征。质谱初步与NIST电子数据库比较，然后通过文献中的所有参考数据确认。

一些检测到的二萜是罕见的物质，先前未进行生物学研究。有时仅在混合物、提取物或甚至油树脂中研究。例如，labda-8(17),13E-dien-15-ol和柯巴烯酸已证明具有抗菌特性。此外，柯巴烯酸和2-氧代柯巴烯酸因其明显的抗真菌活性而被报道。这些发现支持了使用E. oleifera油树脂用于此类治疗目的的理论基础。

得益于使用该工具进行萜烯分析的广泛研究，GC-MS技术允许无需分离即可识别主要化合物。这项研究增强了我们对E. oleifera油树脂及其成分的理解，指导了未来关于分离、生物活性测试和更敏感识别技术的研究。

混合四极杆-轨道阱质谱仪提供了一系列扫描模式，其功能可与传统串联四极杆质谱仪相媲美。例如，产物离子、碎片离子和数据依赖性中性丢失触发扫描模式。最重要的是，Q Exactive质谱仪的Orbitrap分析器是一种捕获设备，而非扫描设备。该工具与天然产物分析中常用的分析方法相比提供了更高的灵敏度，并将进一步应用于Eperua油树脂。

分离

为了明确描述二萜酸的结构，采用了离子交换开柱色谱程序将羧酸与其他非酸性组分（迄今为止为醇类）分离。酸性和非酸性分离使用内部制备的KOH浸渍硅胶进行。随后对酸性部分进行色谱柱分离，在流动相8:2正己烷/乙酸乙酯中得到更纯的部分，通过超高效薄层色谱分析（UHPTLC）确认，与文献和先前分离的标准品比较，显示单一保留因子（Rf）值为0.54。该部分的UHLC–HRMS分析揭示了三种化合物的存在：柯巴酸（C₂₀H₃₂O₂，ESI–HRMS在m/z 303.2330 [M?H]^?），保留时间（Rt）为14.23分钟；硬脂酸（C₂₀H₂₈O₃，ESI–HRMS在m/z 315.1966 [M?H]^?），Rt为13.12分钟；以及一种硬脂酸异构体，Rt为14.02分钟，在TIC和EIC中观察到。

巴塔哥尼亚酸（C₂₀H₂₈O₄，HR–ESI–MS在m/z 331.1915 [M?H]^?）、agathic酸（C₂₀H₃₀O₄，HR–ESI–MS在m/z 333.2071 [M?H]^?）、eperuic酸（C₂₀H₃₄O₂，HR–ESI–MS在m/z 305.2482 [M?H]^?）和pinifolic酸（C₂₀H₃₂O₄，HR–ESI–MS在m/z 335.2227 [M?H]^?）也被识别。

柯巴酸和硬脂酸的结构通过NMR实验确认，但对于异构体未能得出结论。混合四极杆-轨道阱质谱仪提供了一系列扫描模式，其功能可与传统串联四极杆质谱仪相媲美。例如，产物离子、碎片离子和数据依赖性中性丢失触发扫描模式可用。最重要的是，Q Exactive质谱仪的Orbitrap分析器是一种捕获设备，而非扫描设备。该工具与天然产物分析中常用的分析方法相比提供了更高的灵敏度，并将进一步应用于Eperua油树脂。

中性部分包含一种化合物，经过柱色谱分离后，基于其质谱中的裂解模式和红外光谱中的光谱带进行识别。IR光谱显示了对应于呋喃环和α,β-不饱和基团与甲酯羰基共轭的特征带，在1710 cm^?1处。其他带出现在2952、1758、1647、1433、1249、939、754和666 cm^?1。负模式下的全MS分析确认了在m/z 329.1755处存在离子，保留时间为12.03分钟。DDA采集生成了m/z 285.1863和m/z 257.1913的碎片离子。样品制备了三份重复并注入UHPLC–HRMS系统。所有物质的变异系数值均低于10%，包括甲基硬脂酯。

根据文献数据，这对应于硬脂酸甲酯（C₂₁H₃₀O₃），该化合物先前作为次要化合物从Echinodorus grandiflora中分离得到。根据分子式计算的质量误差为0.3 ppm。硬脂酸甲酯的结构也使用1D和2D NMR光谱进行分析，并与先前发布的数据比较。HMBC光谱揭示了硬脂酸二萜结构的特征化学位移相关性，包括C-13（δ 125.58）与H-14（δ 6.24）和H-16（δ 7.18）的相关性；C-16（δ 138.2）与H-15（δ 7.33）；C-14（δ 110.97）与H-15和H-16；以及C-15（δ 142.69）与H-14和H-16。此外，观察到羰基碳C-18（δ 167.86）与甲基质子H₃-21（δ 3.67）以及甲氧基碳C-21（δ 51.14）的相关性，确认该化合物为硬脂酸甲酯。

甲酯先前未在油树脂中作为天然成分报道，这可能与所采用的分析技术有关。酯化是GC中应用于极性分析物的常见做法。羧酸通常以其相应的甲酯形式被观察到，忽略了天然存在甲酯的可能性。据我们所知，这项研究是文献中的首次。为了排除甲酯在分馏过程中作为加合物形成的可能性，还通过直接进样HRMS分析了油树脂，以确认甲酯是一种天然物质，并且天然甲基硬脂酯的存在得到确认。

结论

源自E. oleifera Ducke的油树脂通过GC–MS进行分析，能够检测其先前未报道的主要成分。随后使用KOH浸渍硅胶进行开柱色谱分馏，实现了酸性和中性部分的分离。对酸性部分的进一步分析导致分离出浓缩的硬脂酸和柯巴酸部分，并通过NMR和HRMS实验确认。相比之下，中性部分包含一种天然二萜酯——硬脂酸甲酯——通过红外光谱、HRMS和NMR分析识别。硬脂酸的这种甲基化形式先前未在其天然形式中在油树脂中检测到。直接进样MS通过提供与传统GC–MS方法互补的数据，实现了对该酯的检测。这一发现开启了许多关于天然油树脂中甲酯的研究。

实验部分

植物材料

E. oleifera Ducke的油树脂于2023年6月6日在巴西亚马逊州的马尼科雷采集。访问在SISGEN系统中注册，代码为AAC8B84。

样品制备

样品制备程序包括在小瓶中进行室温衍生化技术。将90微升氯仿加入含有10 μL油树脂的小瓶中。加入50 μL三甲基锍氢氧化物（TMSH）试剂后，手动轻轻摇动小瓶直至获得均匀溶液。总衍生化反应时间为五分钟。最后，用氯仿将混合物定容至小瓶弯月面1 mL，并注入GC。对于MS直接进样，将1 mg样品溶解于1 mL甲醇中（GC级，购自Tedia）。对于UHPLC–HRMS分析，大约1 mg样品称重三份，并定量转移至1.00 mL容量瓶（经过校准，扩展测量不确定度小于0.025 mL）。将容量瓶涡旋1分钟，静置20分钟，然后定容。随后将样品转移至小瓶进行分析。所有储备溶液在?30°C储存。所有使用的容量器具均由LAB CAL定期校准，该实验室是巴西校准网络（CAL 0328 INMETRO）认可的实验室，属于LBCD。

E. oleifera Ducke油树脂的植物化学分析GC–MS分析

使用Shimadzu QP2020 NX系统（Shimadzu Corporation）进行E. oleifera油树脂的GC–MS分析，配备AOC-20i自动进样器和SH-RTX-5 MS柱（Shimadzu），固定相为5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。氦气作为载气，在恒定流速模式下流速为1.35 mL/min。将1 μL酯化油树脂以分流模式（1:10）注入。进样口温度设为250°C，传输线温度也为250°C。柱温箱初始温度设为180°C保持2分钟，然后以2°C/min的速率升至290°C，最后等温保持15分钟。质量分析器在总离子扫描模式（全扫描）下运行，m/z范围30–500。传输线和电离源温度分别设为300°C和320°C。电子电离使用70 eV能量。使用NIST（美国）参考库以及关于先前识别二萜的文献数据解读质谱。成分的百分比组成基于峰面积确定。

KOH浸渍柱色谱

使用离子交换柱色谱与KOH浸渍硅胶进行分馏过程，以分离酸性（极性）部分和中性（非极性）部分。加入改性硅胶和E. oleifera粗油树脂后，用二氯甲烷洗脱柱以获得非酸性组分，将其与二萜羧酸分离。二萜酸在二氯甲烷洗脱期间通过KOH浸渍硅胶保留。随后使用甲醇洗脱作为钾盐的二萜酸。甲醇部分在低压下浓缩并立即用HCl酸化至pH 4–5。加入二氯甲烷，二萜酸在分液漏斗中从有机相（二氯甲烷）中回收。酸性和中性部分均使用旋转蒸发器蒸发，然后在低温下储存直至进一步分离。

柱色谱

使用硅胶（70–230目）作为固定相制备色谱柱，用于化合物的分离和识别。对于每次分馏，称取与样品量比例为1:10的硅胶。将预先浸泡在指定流动相中的硅胶加入玻璃柱中来填充柱。对于酸性部分，流动相起始比例为8:2正己烷/乙酸乙酯，随着在每个梯度收集馏分，极性逐渐增加，直至最终流动相比例达到1:1。对于中性部分，在整个柱中使用9:1（正己烷/乙酸乙酯）的等度流动相。使用旋转蒸发器蒸发溶剂，获得的馏分在低温下储存直至进一步分析。

MS直接进样

Q Exactive Orbitrap质谱仪在正和负ESI模式下运行，并每天使用制造商的校准溶液（Thermo Fisher Scientific）进行校准。ESI参数进一步优化，最终设置：喷雾电压2.9 kV，S-lens电压80 V，毛细管温度380°C，辅助气体加热器温度350°C，氮气鞘气、辅助气和扫气分别设为30、10和1个任意单位。全扫描数据在m/z 100–1000范围内获取，分辨率为140,000 FWHM，自动增益控制（AGC）为1 × 10⁶，最大注入时间（IT）为100 ms。

数据以Full MS/dd-MS²模式（无HCD碎裂）获取，随后进行数据依赖性（dd）扫描并应用碎裂能量。第二次扫描事件的离子进入HCD碰撞池；第一次的离子则不进入。

分析使用高分辨率质谱（HRMS）通过直接进样进行。样品溶解于甲醇中，并在正和负模式下注入ESI电离源。使用Thermo Scientific TraceFinder 4.1软件（Thermo Fisher Scientific），质量容差为±5 ppm。

UHPLC–HRMS参数

使用Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统 coupled to a QExactive Plus混合四极杆 Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher Scientific）配备电喷雾电离（ESI）源。分离在反相柱（Kinetex 2.6 μm PS C18, 100 ?, 100 mm × 2.1 mm; 2.6 μm）在40°C下进行，恒定流速300 μL/min，进样体积5 μL。梯度色谱运行起始于5%流动相B（含0.1%甲酸的甲醇）和95%流动相A（含5 mM甲酸铵和0.1%甲酸的水）。流动相B在1.0分钟时增至10%，2分钟时增至25%，10分钟时增至90%。在14分钟时达到100% B并保持该比例直至16分钟，从16.1到20.0分钟恢复初始色谱条件。

LC流出物泵入质谱仪，在正ESI模式下运行，每天使用制造商的校准溶液（Thermo Fisher Scientific）进行校准。ESI参数进一步优化，最终设置：喷雾电压2.9 kV，S-lens电压80 V，毛细管温度380°C，辅助气体加热器温度350°C，氮气鞘气、辅助气和扫气分别设为30、10和1个任意单位。全扫描数据在m/z 70–1050范围内获取，分辨率为70,000 FWHM，AGC为1 × 10⁶，最大IT为100 ms。

数据以Full MS/dd-MS2模式（无HCD碎裂）获取，随后进行数据依赖性（dd）扫描并应用碎裂能量。第二次扫描事件的离子进入HCD碰撞池；第一次的离子则不进入。

分析使用HRMS通过直接进样进行。样品溶解于甲醇中，并在正和负模式下注入ESI电离源。使用Thermo Scientific TraceFinder 4.1软件（Thermo Fisher Scientific），质量容差为±5 ppm。

精密度评估

精密度通过每个物质的% RSD计算。

傅里叶变换红外光谱分析

使用Hewlett-Packard FTIR仪器获得分离化合物的光谱。少量干燥油状化合物的红外吸收数据在波数范围4000–600 cm^?1内记录。

NMR

分离的二萜酸和甲酯化合物的NMR实验在600 MHz Agilent谱仪上进行，¹H操作频率599.87 MHz，¹³C操作频率150.85 MHz，温度298 K，使用CDCl₃中的5 mm NMR管。使用标准脉冲序列获取光谱。¹H NMR光谱使用单个45°射频激发脉冲获取，谱宽5.38 kHz，采集时间1.52 s，8 k数据点，16次扫描。¹³C NMR光谱使用单个45°射频脉冲获取，谱宽30.5 kHz，采集时间1.05 s，弛豫延迟2 s，32 k数据点。DEPT 135脉冲序列使用30.5 kHz谱宽进行。COSY光谱使用与¹H光谱相同的谱宽进行，1024 (t₂) × 512 (t₁)复数数据点。NOESY光谱应用300 ms混合时间获取。HSQC实验采用绝热碳脉冲和梯度脉冲，获取1024 (t₂) × 256 (t₁)复数数据点，使用16次扫描。HMBC获取1024 (t₂) × 256 (t₁)复数数据点，32次扫描。所有光谱使用MestreNova软件处理和分析。

作者贡献

所有作者为研究的构思和设计做出了贡献。Rayssa Ribeiro：GC–MS进样、结果分析和解读。HRMS实验：Valdir F. Veiga-Junior和Monica C. Padilha。NMR实验：Valdir F. Veiga-Junior、Alvicler Magalh?es和Fernando Hallwass。所有作者审核、评论并批准了手稿的最终版本。

致谢

本研究发表的论文处理费由巴西高等教育人才改进协调委员会（CAPES）（ROR标识符：00x0ma614）资助。

利益冲突

作者声明无利益冲突。