隐藏于城市水域：整合分类学揭示粤港澳大湾区指状软珊瑚两个新物种及其系统发育意义

本研究通过整合形态学与基因组浅层测序技术，在粤港澳大湾区城市水域发现并描述了指状软珊瑚两个新物种：Parasphaerasclera dimorpha sp. nov.（ Parasphaerascleridae科）和Paraminabea inflata sp. nov.（Coralliidae科）。研究通过线粒体基因组（14个PCGs）、MutS和28S rRNA基因构建系统发育树，揭示其演化地位，并首次报道了Paraminabea rubeusa的分子数据。研究发现Parasphaerascleridae是Scleralcyonacea目中早期分化的支系，保留保守基因顺序（GO1），而Coralliidae则呈现7种基因重排模式。研究强调了对高度城市化区域海洋隐存多样性进行记录的紧迫性，为软珊瑚分类和系统发育研究提供了关键分子数据。

　　

引言

指状或叶状硬轴珊瑚目（Scleralcyonacea）软珊瑚在热带珊瑚礁生态系统中十分常见，然而其形态可塑性和遗传信息不足阻碍了人们对这类生物多样性的理解。在中国海域，此前仅记录到4种此类物种，均属于Coralliidae科的Paraminabea属。本研究从香港和珠海城市水域采集到8个硬轴珊瑚目软珊瑚标本，初步鉴定涉及Paraminabea rubeusa以及两个未描述物种——分别属于Parasphaerasclera和Paraminabea属。本研究旨在通过形态描述和浅层基因组测序（即基因组浅层测序）技术获取DNA序列（线粒体基因组和28S rRNA），确定这三个物种在硬轴珊瑚目系统发育框架中的位置，并评估这些珊瑚中线粒体基因顺序重排事件。

材料与方法

样品采集

样品通过水肺潜水采集自香港宋岗和珠海荷州岛附近水域，深度范围为14.5至25米。共采集到两个Parasphaerasclera dimorpha sp. nov.群体、五个Paraminabea inflata sp. nov.群体以及一个Paraminabea rubeusa群体。新物种的模式标本保存于中国科学院南海热带海洋生物标本馆（TMBC）。

形态学观察

取珊瑚群体不同部位的组织，用10%次氯酸钠溶解，并按Williams和Mattison（2018）描述的程序制备。干燥的骨针置于样品台上，喷金后使用扫描电子显微镜（LEO 1530场发射扫描电镜或Phenom Pro G6台式电镜）观察。

DNA提取与测序

使用QIAGEN DNeasy Tissue & Blood Kit提取三个物种的组织样本的基因组DNA，通过NanoDrop 2000分光光度计检测DNA质量与浓度。样本用于制备DNA文库，并在诺禾致源（Novogene）使用Novaseq 6000平台进行测序，产生150 bp双端读长。

数据处理、系统发育和遗传距离分析

使用Trimmomatic v.0.59对原始数据进行修剪和过滤，SPAdes v.3.15.5进行组装。通过BLAST搜索从五个标本中提取线粒体基因组、MutS和28S基因。使用MITOS2和Geseq注释线粒体基因组，并通过BLASTn进一步确认各基因序列。使用Chloroplot绘制线粒体基因组结构特征。

系统发育分析使用PhyloSuite v.1.2.3及其插件进行：Mafft v.7.505和trimAL v.1.2进行比对和修剪；Modelfinder v.1.5.4选择最佳模型；IQ-TREE2 v.2.2.0进行最大似然（ML）分析（10000次超快速自举）；MrBayes v.3.2.7a进行贝叶斯推断（BI）分析（100万次MCMC迭代）。使用iTOL v.5绘制系统发育树。

基于MutS矩阵（去除所有空位后573 bp）使用MEGA 11计算Kimura 2-parameter（K2P）遗传距离，并使用ASAP v.1.0进行物种界定分析。使用TreeRex v.1.8基于公共区间算法检测软珊瑚科的基因顺序重排事件。

结果

基于单基因的系统发育关系和物种界定

分子系统发育和遗传距离分析用于界定物种并确定新物种与其他Paraminabea和Parasphaerasclera软珊瑚的关系。在十个已描述的Paraminabea物种中，此前仅有Param. aldersladei拥有相应的分子数据。基于MutS和28S的系统发育分析显示，Param. inflata sp. nov.与Param. rubeusa和Param. aldersladei遗传距离较远。基于MutS基因，Paraminabea物种间的K2P遗传距离均小于2.0%，其中Param. inflata与Param. aldersladei的差异为1.24%，与Param. rubeusa的差异为1.77%，而Param. aldersladei与Param. rubeusa的差异为0.88%，支持将Param. inflata认定为一个新物种。

在十个已认识的Parasphaerasclera物种中，此前有七个物种的分子数据可用。然而，用于测序MutS基因的Paras. aff. grayi和Paras. grayi标本被置于不同的进化枝中，两者的K2P距离为2.0%，高于该属其他物种间的种间距离。在28S树中，一个序列（登录号HG970068）与Paras. aurea和Paras. dimorpha构成姐妹群，另一个序列（登录号KF728087）与Paras. kimberleyensis形成一个进化枝。实际上，当去除MutS比对中的所有空位后，对应于登录号DQ302809的个体和Parasphaerasclera sp.与Paras. kimberleyensis完全相同，与物种界定结果一致。对于MutS树，使用BI分析恢复了两个主要进化枝：（valdiviae + rotifera）和（kimberleyensis +（mcfaddenae +（hongkongensis +（grayi + aurea）））。Paras. mcfaddenae的位置由于ML和BI结果之间的冲突而不稳定。尽管如此，在MutS和28S树中，Paras. dimorpha被恢复为Paras. grayi和Paras. aurea的姐妹物种。在合并三个相同的Paras. kimberleyensis序列后，计算显示Paras. dimorpha sp. nov.与Paras. grayi和Paras. aurea的差异为0.88%，但Paras. grayi与Paras. aurea的关系更近，差异为0.70%，支持Paras. dimorpha sp. nov.为一个 distinct species。

线粒体基因组揭示的系统发育关系和基因顺序

三个物种的完整线粒体基因组长度从18,301 bp到19,997 bp不等，具有负的AT偏斜和正的GC偏斜。使用现有线粒体基因组构建了硬轴珊瑚目软珊瑚科的系统发育关系，并检查了基因重排模式。系统发育分析显示，Parasphaerascleridae代表硬轴珊瑚目最早分化的进化枝，是该目所有其他科的姐妹群。在这个与Paraphaerascleridae姐妹的大进化枝中，Telestula MT254527是一个包括六个科（即Parisididae +（Sarcodictyonidae +（Erythropodiidae +（Ideogorgiidae +（Briareidae + Spongiodermidae））））的进化枝和一个包括Coralliidae及其余科的进化枝的姐妹。这两个进化枝分裂为15个科，具有较高的支持值（UFB > 95, BPP > 0.95）。Telestula MT254527的科级地位需要进一步研究。

在可用的软珊瑚线粒体基因组中发现了七种基因排列类型。将基因顺序信息整合到系统发育树中，可以清楚地看到，以Parasphaerascleridae为代表的线粒体基因顺序（即GO1）是硬轴珊瑚目的 ancestral state。基因顺序的变化与科级拓扑结构所揭示的关系很好地吻合。大多数软珊瑚科（10/16）表现出与Parasphaerascleridae相同的基因排列（GO1）。三个Parasphaerasclera线粒体基因组表现出相同的基因顺序（GO1）。Chrysogorgiidae、Primnoidae和Ifalukellidae共享相同的基因顺序（GO2），而Isidoidae（GO3）和Keratoisididae（GO4）则表现出另外两种基因排列。包含cox1-rrnS-nad1的基因块在所有基因顺序类型中都是保守的，其他14个基因观察到重排。与GO1相比，GO2包含13个基因的基因块发生了倒位。然后，Isidoidae和Keratoisididae的进化枝都表现出与GO2相比的三个重排事件，包括cytb的转座和基因块trnM-cox3-atp6-atp8-cox2的转座，以及基因块cytb-trnM-cox3-atp6-atp8-cox2的反向转座。与GO3不同，Keratoisididae（GO4）进一步表现出基因块cytb-nad6-nad3-nad4L的反向转座变化。在这些软珊瑚科中，Coralliidae物种表现出复杂的重排变化（GO5）。代表Coralliidae最早分化进化枝的Paraminabea，与GO1相比，表现出基因块MutS-rrnL-nad2-nad5和nad4L-nad3-nad6的两个反向转座。在Coralliidae科内的七个属中鉴定出四种基因排列类型（GO5）。与Paraminabea相比，发生了七个重排事件，这些事件与其系统发育关系一致。

系统学

Parasphaerasclera dimorpha sp. nov.

标本检查：SCSTMBC240253（正模）和SCSTMBC240254（副模），两个标本，香港宋岗岛以东，22.193850° N, 114.280363° E，水肺潜水，深度15米，2024年6月12日由Haixin Loke采集。

鉴别特征：指状或分枝状，浅红橙色，高70毫米，直径20毫米（正模SCSTMBC240253，采集后尺寸缩小），个员短，具八个触手。息肉中无骨针。

模式产地：中国香港宋岗，15米。

描述：群体具指状或分枝状生长形，具宽而无个员的柄。群体大小可变，但大多为类似的指状，两个采集的指状群体长65-70毫米，直径18-20毫米。在酒精中，尺寸显著缩小约一半。基部无个员，短。个员半透明，单型，可收缩，收缩时产生黄色的共肉丘。共肉丘的高度与完全伸展时的触手长度相似。八个触手，每个触手边缘各有两排6-9个羽状分枝。

息肉骨针缺失。所有共肉和柄骨针具不规则瘤状突起。对于具共肉丘的共肉，大多数骨针为瘤状帽形，一些略呈棒状，一些呈片状，还有十字形和少量小棒状。共肉骨针高0.035-0.073毫米，直径0.020-0.067毫米。在柄表面组织中，骨针为纺锤形、棒状、十字形和不规则形，高0.052-0.106毫米，直径0.032-0.086毫米。

颜色：原位时，群体浅橙红色，具小的、明亮的、黄色的圆形共肉丘。无个员的匍匐基部胡萝卜色。个员包括触手呈乳白色半透明。在酒精中保存后，群体呈锈红色。骨针橙色。

生境：散布于也聚居着太阳珊瑚和一种Dendronephthya sp.的巨砾上。

词源：以其观察到的两种群体形态命名。

分布：该物种目前仅知于香港东部水域。

备注：在Parasphaerasclera属内，十个有效物种（本研究前）分布在三个生物地理区域：南非（Paras. aurea, Paras. morifera, Paras. rotifera, Paras. valdivae）、西澳大利亚和墨西哥湾（Paras. grayi, Paras. kimberleyensis, 和Paras. mcfaddenae）以及西太平洋（Paras. albiflora, Paras. grayi, Paras. nezdoliyi, Paras. zanahoria）。值得注意的是，尽管大多数Paras. grayi的观察是在西澳大利亚，但Benayahu等人（2004）报道了该物种来自台湾南部水域、东海，比其他物种更接近我们新物种的产地。Parasphaerasclera dimorpha sp. nov.是该属从中国海域报道的唯二物种，并表现出双重形态亲和性（指状或分枝形）。与其他同属物种相比，Paras. dimorpha sp. nov.在指状具宽基方面更类似于Paras. grayi。但这两个物种可以很容易地区分（Bryce等人2015）：(1) 颜色：Paras. dimorpha为浅橙红色，Paras. grayi为明亮的锈橙色；(2) 生长形：Paras. dimorpha为指状或分枝状，Paras. grayi为固着形（具连接基部的双指状）；(3) 骨针形态：Paras. dimorpha的柄骨针包括纺锤形，而Paras. grayi的柄骨针为具长光滑杆的棒状。

Paraminabea inflata sp. nov.

标本检查：SCSTMBC240255-SCSTMBC240259，五个标本，香港宋岗岛周围（SCSTMBC240255，正模，SCSTMBC240256-SCSTMBC240258，副模）和珠海荷州岛（SCSTMBC240259，副模），水肺潜水，深度14.5-25米，2023年9月、2024年5月和6月由Sam Yiu、Haixin Loke和Lan Liu采集。

鉴别特征：小，圆顶形或指状，有时双生群体在基部连接，黄色或橙色群体，直径9至24毫米，高9至46毫米。二型个员为黄色和白色。个员长，具细长身体。个员中无骨针。

模式产地：中国香港宋岗岛，14.5米。

描述：群体呈圆顶形（SCSTMBC240256）、指状（SCSTMBC240255和SCSTMBC240259）、或成对圆顶连接约2.5毫米扩展基（SCSTMBC240257）、或圆顶-叶状连接约0.5毫米扩展基（SCSTMBC240258）。单群体大小高9-46毫米，宽9-24毫米。成对圆顶（SCSTMBC240257），小圆顶直径9毫米，高9毫米，大圆顶直径15毫米，高29毫米。无个员的基部部分短。在酒精中保存后没有明显的颜色和大小变化。个员具细长身体。收缩时，共肉丘黄色。

个员骨针缺失。具共肉丘的共肉，骨针大多为具六、七、八个辐射肋的桶形、具中腰的双头形、具细长腰的纺锤形，以及一些具六个辐射肋的十字形。共肉骨针大小可变，高0.041至0.106毫米，直径0.027至0.090毫米。柄骨针大多为类似大小的亚球形，具非常短而粗的腰（有时几乎看不见），表面具小辐射肋的不规则形，粗桶形，一些具中腰的双头形（SCSTMBC240256），或具六个辐射肋的十字形（SCSTMBC240256）。柄骨针高0.051至0.115毫米，直径0.049毫米至0.100毫米。

颜色：活体和保存的群体呈黄色和橙色；伸展的个员呈白色，但收缩时观察到黄色基部。无个员的基部红色或黄色。个员透明，具白色触手。骨针桃红色。

生境：稀疏分布或聚集，基部附着于岩石表面。

词源：以其群体形状命名，像膨胀的海绵耳塞。

分布：该物种目前仅知于香港和珠海水域。iNaturalist网站有14条该物种的记录，从香港东部（吊钟洲）到南部（南丫岛），但被错误地识别为Paraminabea hongkongensis。

备注：本研究前有十个现生Paraminabea物种。根据HKRMS，香港已记录三个物种，包括Param. indica、Param. hongkongensis和Param. rubeusa。其中，Param. rubeusa与其他三个物种的不同在于其分枝生长形和不同的骨针形状，例如具刺的细长纺锤形骨针。在Param. inflata sp. nov.的共肉和柄中观察到相同的骨针形状，即具六个辐射肋的十字形，在Param. rubeusa和Param. hongkongensis中也观察到这种骨针。据报道，其他Paraminabea物种缺乏此类骨针。尽管Param. inflata sp. nov.与Param. hongkongensis共享相似的骨针形状，但Param. hongkongensis缺乏在Param. inflata sp. nov.中发现的两种骨针：共肉中的纺锤形骨针和柄中具短腰的亚球形骨针。Param. inflata sp. nov.的群体大小范围为9毫米至46毫米，而在洞穴中发现的Param. hongkongensis约为20毫米。需要进一步检查Param. hongkongensis以澄清大小差异的意义。此外，Param. indica（模式产地在印度洋）缺乏瘤状球形和具六个辐射肋的十字形骨针形状，并且其个员仅分布在群体的一半。Param. aldersladei在共肉和柄中拥有瘤状球形方面类似于Param. inflata sp. nov.，但我们仅在Param. inflata sp. nov.的柄中观察到此类骨针，且腰更粗。此外，Param. aldersladei可以通过个员形状（完全收缩的个员）和骨针分布（在共肉和柄基中观察到相似的骨针形状）与Param. inflata sp. nov.区分开来。

讨论

我们的整合形态学和遗传学分析支持承认Paras. dimorpha sp. nov.和Param. inflata sp. nov.。Paraminabea和Parasphaerasclera以其令人困惑的表型变异性而闻名，其鉴定严重依赖于骨针形态和分子数据。Param. inflata sp. nov.群体在历史上被错误地识别为Param. hongkongensis，并与Paras. rubeusa一起被发现。类似地，Paras. dimorpha sp. nov.在本研究之前被错误地识别为Param. hongkongensis，其群体与Param. inflata sp. nov.在宋岗共存。

Parasphaerascleridae科很小，有11个物种。这些物种通常栖息在约10米（Paras. kinberleyensis）至85米（Paras. mcfaddenae）的深度，一些在洞穴中形成种群。大多数物种表现出单一生长形（指状或叶状），除了三个物种表现出形态可塑性——Paras. dimorpha sp. nov.、Paras. valdivae和Paras. rotifera——它们拥有具明显柄和分枝的额外形态。这三个物种可以通过个员收缩性、骨针形状和地理分布来区分。Paras. grayi是一个形态多变、分布广泛（印度-西太平洋和西澳大利亚）的物种，比其他物种更类似于Paras. dimorpha sp. nov.，特别是在其指状形状和邻近性（台湾南缘）。值得注意的是，Paras. dimorpha sp. nov.的橙色和柄中的纺锤形骨针，结合0.88%的MutS差异，在形态和遗传上将其与Paras. grayi区分开来。此外，Paras. dimorpha sp. nov.是第二个观察到具瘤纺锤体的物种，这一特征它与Paras. mcfaddenae共享，尽管这些纺锤体在前者中更短且更不常见。

尽管Paras. dimorpha sp. nov.和Param. inflata sp. nov.在群体形状上相似，但它们的柄大小、骨针形态和遗传谱系明显不同。Param. rubeusa和Param. inflata都栖息在更深水域的岩石表面，延伸至25米，但它们的群体形状、颜色和骨针形态不同。香港的另外两个Paraminabea物种，Param. hongkongensis和Param. indica，在群体和柄骨针形态上与Param. inflata sp. nov.不同。在Paraminabea物种中，Param. inflata sp. nov.柄中的瘤状球形骨针类似于Param. aldersladei的骨针，尽管它们的球形分布和个员形状不同。不幸的是，大多数Paraminabea物种缺乏遗传数据阻碍了系统发育重建，仅有三个拥有可用MutS序列的物种显示出0.88%至1.77%的差异。这两个新物种栖息在能见度低、水交换频繁的深海岸水域（>10米），可能适应高浊度，通过滤食悬浮颗粒增强食物获取。生态上，作为栖息地工程师，它们创造了复杂的结构，支持底栖生物多样性并调节沉积物动力学。此外，作为生化储库，它们的次生代谢物可能是新生化物质的来源。

我们的研究不仅揭示了Paras. dimorpha sp. nov.和Param. inflata sp. nov.之间的形态差异，还产生了DNA序列，从而能够确定它们在硬轴珊瑚目系统发育树中的位置，为了解指状生长形的趋同进化提供了更广阔的理解。Parasphaerascleridae在硬轴珊瑚目中的位置在先前的研究中在核和线粒体位点之间不一致。尽管线粒体基因替换率低，但我们拥有78个物种14个PCGs的数据矩阵支持Parasphaerascleridae进化枝与其他科的区别，这与基因顺序结果一致。这与使用MutS的硬轴珊瑚目双进化枝拓扑结构形成对比，其中包括一个由Parasphaerascleridae和Coralliidae组成的进化枝。MutS是本研究和先前研究中诊断软珊瑚物种的强大遗传标记。然而，MutS或整个线粒体基因组信息位点不足限制了它们在大尺度上的分辨率，需要来自组学数据的大量标记（即超保守元件）来重建硬轴珊瑚目软珊瑚可靠的系统发育关系。凭借稳健的科级拓扑支持，我们探索了基因重排事件的系统发育模式，特别是在Coralliidae内。在16个硬轴珊瑚目软珊瑚科中鉴定出七种基因顺序，其中只有“cox1-rrnS-nad1”块在它们之间是保守的，表明这些软珊瑚中存在复杂的进化模式，尤其是在Coralliidae内。

结论

我们描述了Parasphaerasclera dimorpha sp. nov.和Paraminabea inflata sp. nov.，得到了坚实的形态学和分子证据的支持。这项工作增强了我们对这两个主要以指状或叶状软珊瑚属生物多样性的认识。值得注意的是，Paras. dimorpha是从中国海域报道的第一个Parasphaerascleridae物种。对于所研究的三个物种，包括Param. rubeusa，我们提供了第一套DNA序列，这使我们能够确定它们的系统发育位置。我们对三个物种线粒体基因组的组装为更好地分析硬轴珊瑚目内的基因顺序重排提供了新颖的数据。