可诱导挥发性化学信号驱动哈茨木霉GD12在对抗核盘菌过程中的抗真菌活性

本研究揭示了哈茨木霉(Trichoderma hamatum)GD12菌株通过产生挥发性有机化合物(VOCs)抑制植物病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)的新型机制。研究发现共培养可显著上调VOCs产生，其中1-辛烯-3-酮(1-octen-3-one)展现出强效广谱抗真菌活性。该研究为开发基于微生物挥发性信号的绿色农药提供了重要理论依据，对可持续农业病害防控具有重要价值。

　　

引言

核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一种全球分布的土传植物病原真菌，可侵染约800种植物物种，包括胡萝卜、生菜、向日葵、油菜和马铃薯等重要经济作物。目前对该病原菌的管理主要依赖合成杀菌剂，但过度使用导致抗药性菌株出现。轮作等替代方法因核盘菌能形成可存活8年以上的菌核而效果有限。工程作物抗性也因病原体不同致病型和主要作物缺乏抗性资源而面临挑战。因此，需要更可持续的病原体管理方法。

可持续管理策略包括利用微生物生物防治剂，如有益土壤真菌。这些真菌通过直接拮抗病原体、资源竞争或调节植物防御反应来降低病原体危害。木霉属(Trichoderma)是研究最深入的有益土壤真菌之一，具有抑制真菌病原体发育、诱导植物防御反应和促进植物生长的能力。GD12是哈茨木霉(T. hamatum)的一个菌株，在泥炭微环境中能有效抑制核盘菌生长，其抑制能力需要几丁质酶基因N-乙酰-β-葡萄糖胺苷酶。基因组测序显示GD12含有32个沉默基因簇，包括非核糖体肽合成酶(NRPSs)、I型聚酮合酶(PKSs)和萜烯合酶，这些基因簇可能在土壤中与拮抗微生物共存时被激活，产生标准实验室条件下不产生的次级代谢产物。

挥发性有机化合物(VOCs)是一类低分子量次级代谢产物，由土壤微生物等多种生物产生，有助于它们在土壤中与邻近生物竞争资源。VOCs能够在土壤的气体和水分填充空隙间传播，作为长距离信使。微生物VOCs参与多种生物活动，包括直接抑制病原微生物、诱导植物防御病原体和促进植物生长。多项研究表明木霉VOCs能特异性抑制多种真菌病原体。

虽然有益土壤微生物在标准实验室条件下生长时能产生VOCs，但它们在土壤基质中存在于复杂群落中。真菌基因组测序表明，许多次级代谢基因簇在标准实验室条件下是沉默的和端粒的，可能需要特定培养条件才能激活它们，包括应激诱导或与不同微生物物种共培养。实验上通过在同一密闭空间接种不同微生物物种来重现更自然的微生物相互作用环境是可行的。这种方法可以刺激激活沉默基因簇的拮抗作用，从而促进新型生物活性化合物的发现。

材料与方法

研究使用从马铃薯田分离的哈茨木霉GD12菌株和从油菜花瓣分离的核盘菌1号分离株。通过双重培养对抗试验，将GD12和核盘菌共同接种在PDA平板上，在24°C、16小时/8小时光暗周期下培养7天。

采用动态顶空收集技术收集挥发性化合物，使用Porapak Q吸附管收集20小时。为研究时间动态，使用固相微萃取(SPME)技术在接种后1、2、3、4、5、6、7、10、17和24天取样。

使用气相色谱-火焰离子化检测器(GC-FID)和气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析挥发性化合物。通过Kováts指数(KI)和与真实标准品共注射确认化合物鉴定。

合成化合物实验使用倒板生物测定法，将含有合成VOCs的滤纸片置于含有病原菌的平板之上，确保VOCs样品与病原菌之间没有物理接触。测试了1-戊醇、1-辛烯-3-醇、1-辛烯、2-十一烷酮、2-辛酮、3-辛酮、2-戊基呋喃、6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PAP)和1-辛烯-3-酮等化合物。

结果

双重培养对抗试验显示，GD12与核盘菌共培养7天后产生抑真菌相互作用，并在两种真菌之间的相互作用区形成黄色孢子。

与自我挑战的GD12处理相比，GD12与核盘菌共培养时挥发性化合物的产生出现显著定量和定性变化。共培养中检测到36种化合物，其中22种是GD12-核盘菌共培养独有的，表明这些VOCs是在核盘菌存在下新生物合成的，或在GD12单一培养中低于检测限。6-戊基-2H-吡喃-2-酮(6-PAP)在共培养中占主导地位，平均产量显著高于自我挑战对照组。

时间过程实验显示，三种化合物的峰值诱导发生在共培养后17天，随后到24天下降。在GD12与核盘菌共培养处理中，化合物1(KI=1252)直到第6天才在顶空中检测到，第10天产量增加，第17天进一步增加，随后到第24天下降。6-PAP和化合物2(KI=1994)显示相似趋势。

合成化合物实验显示，在最高剂量(45.5μM)下，不同VOCs对核盘菌菌丝面积有显著差异抑制作用。1-辛烯-3-酮表现出完全生长抑制，这种抗真菌活性对其他经济上重要的真菌病原体(灰霉病菌、油菜花瓣病菌和小麦全蚀病菌)也有效。

在测试的VOCs中，选择五种显示最显著抑制的化合物在降低剂量下进一步研究。2-辛酮的最小抑制剂量为11.125μM，3-辛酮为4.55μM，2-戊基呋喃为4.55μM，2-十一烷酮为2.275μM。显示最大抑制的化合物1-辛烯-3-酮在100倍稀释(0.445μM)下仍具有显著抑制性。

为确定1-辛烯-3-酮抗真菌活性的潜在结构部分，测试了结构与1-辛烯、3-辛酮和(RS)-1-辛烯-3-醇相似的化合物。1-辛烯对核盘菌没有显著抑制，而3-辛酮和(RS)-1-辛烯-3-醇显示显著抑制，但只有1-辛烯-3-酮表现出100%抑制。当核盘菌从与1-辛烯-3-酮共享的大气中移除后，病原菌的生长在移除4周后没有恢复，表明1-辛烯-3-酮在测试剂量下具有杀菌活性。

讨论

本研究显示哈茨木霉GD12在与真菌病原体核盘菌共培养时发生VOCs产生的诱导，包括在无菌生长时不产生的VOCs。虽然在自我挑战的GD12对照中也产生了几种VOCs，但共培养中VOCs产生的刺激表明在病原体存在下产量上调，其中一些被证明对核盘菌具有抗真菌作用。

许多研究木霉VOCs产生的研究利用无菌真菌生长，VOCs主要归属于醇类、酮类、烷烃、呋喃类、单萜和倍半萜类。本研究中哈茨木霉GD12产生的几种低分子量化合物先前已从其他木霉物种中鉴定出来。据我们所知，这是哈茨木霉产生1-辛烯-3-酮的首次报道，尽管已从绿木霉中鉴定出该化合物。

与自我挑战的GD12对照相比，与核盘菌共培养揭示了VOCs产生的显著定量和定性变化。这种诱导在17天后最大，与其他研究一致。两种使用合成标准品鉴定的化合物2-戊基呋喃和2-辛酮在GD12与核盘菌相互作用期间新生物合成。虽然很难将这些化合物的产生归因于GD12或核盘菌，但2-戊基呋喃先前已报道由哈茨木霉在无菌培养中产生，深绿木霉和绿木霉产生2-辛酮。

共培养中许多上调的化合物属于倍半萜类，先前在物理真菌-真菌相互作用中观察到。倍半萜是众所周知的化学信号类别，已在一系列木霉物种中分离出来。许多这些倍半萜类化合物对一系列植物病原真菌、细菌和海洋浮游植物具有抗真菌活性。除了抗菌作用外，微生物倍半萜还具有一系列其他生物活性，包括信号传递、宿主生长促进和防御。共培养中未知倍半萜的上调可能表明这些化合物在对抗核盘菌的拮抗反应中具有生物学作用。

6-PAP在共培养中主导GD12的VOCs谱，相对于自我挑战的哈茨木霉GD12培养，这证实了先前的工作，即当哈茨木霉与立枯丝核菌共接种时，6-PAP产量显著增加。虽然共培养中观察到6-PAP产量显著增加，但在倒板测定 setup 中应用6-PAP时未观察到抗真菌活性。然而，多项研究表明6-PAP对一系列真菌病原体具有抑制作用，包括镰刀菌属物种、灰霉病菌、破坏性柱孢菌和立枯丝核菌。最近的工作鉴定了一个负责绿木霉中6-PAP生物合成的I型聚酮合酶(Pks1)，当删除时，在对立测定中观察到对灰霉病菌和立枯丝核菌的拮抗作用丧失。这些研究表明6-PAP可能需要直接接触才能有效的抗真菌活性。

除了6-PAP上调外，共培养处理中2-辛酮产量显著上调，表明哈茨木霉-核盘菌拮抗作用。2-辛酮上调也在真菌病原体Setophoma terrestris与有益土壤细菌枯草芽孢杆菌的相互作用中观察到，以及绿木霉与尖孢镰刀菌的相互作用中观察到，表明该化合物在拮抗真菌相互作用中具有更广泛的作用。

哈茨木霉GD12在自我挑战和与核盘菌共培养中产生的许多VOCs对核盘菌显示出显著抗真菌活性。这里2-辛酮的抗真菌作用与对土壤真菌病原体Setaphoma terrestris的抑制一致，可能表明对一系列真菌病原体具有广谱抑制活性。类似地，2-庚酮先前已显示对弯孢菌和早疫病菌的显著抑制。这里，我们报道仅在其他化合物最高测试剂量下2-庚酮具有中等抗真菌活性，这可能与研究中测试的剂量差异有关，或2-庚酮对不同病原物种的抗真菌活性特异性有关。或者，它可能反映抗真菌作用可能来自2-辛酮通过更复杂土壤微生物组中可能发生的进一步修饰，而不是我们的双组分实验系统。

2-十一烷酮的抗真菌活性特异性已被观察到，该化合物对大丽轮枝菌、尖孢镰刀菌、灰霉病菌和Monilinia spp.显示出抑制作用，但对青霉属物种没有抑制作用。在鉴定出一系列抗真菌化合物后，确定这些抗真菌活性对抗核盘菌的作用模式是重要的下一步。此外，虽然几种哈茨木霉VOCs的抑制特性已证明对抗核盘菌，但重要的是确定在其抑制剂量下的化合物没有植物毒性作用。有趣的是，在核盘菌存在下上调并对病原体显示出抗真菌作用的2-戊基呋喃，也具有可证明的植物生长促进能力。因此，2-戊基呋喃可能是有希望的替代合成化学投入的候选物，因为它能够抑制真菌病原体而不影响植物生长。

据我们所知，这是首次证明1-辛烯-3-酮对抗病原体的抗真菌作用的报告。虽然与单一培养相比，1-辛烯-3-酮在共培养中没有显著上调，但其抗真菌活性仍然值得注意，可能表明组成型产生。当测试结构相关化合物时，3-辛酮和(RS)-1-辛烯-3-醇显示对核盘菌的显著抑制，但只有暴露于1-辛烯-3-酮时核盘菌绝对没有生长。因此，杀菌活性可能通过后者化合物内的α,β-不饱和羰基结构的迈克尔型接受而增强。几个嗜球果伞素类杀菌剂也含有共轭酮和烯烃部分。

这里的发现与Xiong等人报道的相反，他们发现用1-辛烯-3-醇处理镰刀菌和尖孢镰刀菌有显著抑制，但用1-辛烯-3-酮处理真菌没有抑制。然而，VOCs在每个实验中的给药方式不同，使得交叉比较困难。Xiong等人测试的VOCs补充到生长培养基中并与镰刀菌物种直接接触，而这里测试的VOCs与核盘菌物理分离，表明1-辛烯-3-酮的抗真菌作用在一定距离起作用。需要比较研究直接比较本研究中使用的方法与Xiong等人的方法以确认这一点。一个重要的考虑是，在两个研究中，(RS)-1-辛烯-3-醇作为外消旋混合物测试，尽管先前的工作显示手性可以影响其抗真菌活性。

虽然1-辛烯-3-酮显示出对抗核盘菌的抑制作用，但未来的工作应确定该化合物对植物生长的作用。例如，1-辛烯-3-酮暴露显著抑制拟南芥生长和发育，因此未来的工作应侧重于确定哪种剂量的1-辛烯-3-酮可以抑制核盘菌而不影响植物生长。

由于这里鉴定的化合物在体外显示出对抗核盘菌的拮抗作用，立即优先事项将是在温室条件下使用泥炭微环境测试这些化合物单独和组合对抗核盘菌。这些数据将为未来的开放田间试验提供信息，以检查它们在更农业相关条件下的生物活性。

结论

本研究表明挥发性化学信号在哈茨木霉GD12对抗核盘菌的拮抗反应中发挥作用，并显示某些木霉衍生的VOCs对病原体起抑制作用。具体地，我们鉴定1-辛烯-3-酮作为一种潜在的新型抗真菌VOC。需要这里鉴定的抗真菌化合物的进一步温室和田间测试，以确定它们是否在更大规模、更农业相关的条件下抑制病原体。虽然这里已鉴定出几种这些化合物，或先前描述过，但许多在对抗真菌植物病原体时上调的哈茨木霉化合物仍有待鉴定和表征。