添加凝结魏茨曼氏菌GBI-30的益生性Minas Frescal干酪：蛋白质组学分析、流变特性及脂肪酸组成的研究及其对功能乳制品开发的启示

本刊推荐：本研究深入探讨了在Minas Frescal干酪中添加不同剂量（6、8和10 log cfu/g）的孢子形成益生菌Weizmannia coagulans GBI-30对其蛋白质组（ bioactive peptides）、流变学特性（rheological properties）及脂肪酸组成的影响。研究发现，益生菌的添加促进了具有潜在抗高血压（ACE inhibitory）、抗菌、抗糖尿病和免疫调节活性的生物活性肽的释放，同时显著提高了不饱和脂肪酸（MUFA和PUFA）的比例，改善了产品的脂质健康指数（AI和TI）。此外，益生菌干酪表现出更高的硬度（firmness）和内聚性（cohesiveness），结构特性得到增强。结果表明，添加6 log cfu/g的W. coagulans是改善产品品质并赋予其健康益处的经济有效策略，为开发新型功能性乳制品提供了重要理论与实践依据。

　　

引言

功能性食品近年来推动了益生菌市场的扩张，因其对肠道健康的积极作用。全球益生菌市场在2023年达到55.6亿美元，预计2024年至2032年的复合年增长率（CAGR）为6.9%。益生菌是活的微生物，当摄入足够量时，可为宿主带来健康益处，并需在到达结肠（其主要作用部位）时保持存活才能实现临床效益。因此，有效开发益生菌食品需要确保微生物在整个生产链、储存和消费过程中的稳定性和存活率的策略。选择抗性菌株和合适的食品基质对于保持其功能性至关重要。

近年来，芽孢杆菌属（Bacillus）的益生菌菌株因其相对于传统的乳杆菌属（Lactobacillus）和双歧杆菌属（Bifidobacterium）菌株的技术优势而受到显著关注。孢子形成细菌（如芽孢杆菌菌株）对压力加工技术具有更好的抵抗力，并在储存期间表现出更好的稳定性。因此，使用天然更具韧性的菌株是工业应用的一个有前景的策略。

凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans），以前称为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），是一种无毒、非致病性、非抗生素抗性的芽孢杆菌菌株。欧洲食品安全局（EFSA）认为它是一种安全菌株，被公认为一般公认安全（GRAS）和合格推定安全（QPS）状态。一些研究已经证明了它在不同健康障碍中的积极作用，包括细菌性阴道病、肥胖和与肠易激综合征相关的重度抑郁等非胃肠道疾病。

食品基质在益生菌的存活中起着关键作用。新鲜干酪是一种优秀的递送载体，因为其内在特性支持不同益生菌菌株的存活，如高水分和pH值、低钠含量。Minas Frescal是一种典型的巴西新鲜干酪，呈现白色、质地柔软和温和的酸味。此外，Minas Frescal在巴西全国范围内具有广泛的感官接受度。

然而，在新鲜干酪中添加凝结魏茨曼氏菌的研究仍然有限。最近的一项研究表明，该菌株在Minas Frescal干酪的保质期内表现出优异的存活率，同时产生对消费者健康有积极影响的生物活性肽。然而，它的添加可能通过改变肽谱、脂肪酸组成和流变参数来影响其结构特性。因此，本研究调查了添加不同剂量的凝结魏茨曼氏菌GBI-30（0、6、8和10 log cfu/g）对Minas Frescal干酪的肽谱、脂肪酸组成和流变特性的影响。

材料与方法

Minas Frescal干酪加工

Minas Frescal干酪按照传统方案制造。整个实验使用来自同一批次的10升全脂巴氏杀菌牛奶（按重量计3%的脂肪，Itaocara，里约热内卢，巴西），分为相似部分以最小化变异性。每次加工使用约3.3升牛奶，每个干酪重约250克。将牛奶加热至35–37°C，加入40%氯化钙（30毫升/100升；Vetec，里约热内卢，巴西）、85%乳酸（0.4毫升/升；Macalé）和液体凝乳酶（8毫升/升，Ha La，Chr. Hansen，Valinhos，圣保罗，巴西），并手动搅拌后进行凝固。之后，将凝乳切成2厘米的立方体，缓慢搅拌5分钟。接下来，进行部分乳清排水，随后加入氯化钠（牛奶体积的1%；Cisne，里约热内卢，巴西）和凝结魏茨曼氏菌GBI-30（Ganeden Biotech，冻干形式，0.67、6.7和670毫克对应0、6、8和10 log cfu·g^?1；干酪Qc、QI、QII和QIII），并额外静置30分钟。重要的是，67毫克的粉末，仅包含营养细胞，对应9 log cfu.g^?1的凝结魏茨曼氏菌GBI-30孢子。

接下来，凝乳在5°C下进行完全乳清排水和成型30分钟，随后进行两次30分钟的翻转。然后，将干酪放入聚乙烯薄膜中，并在5°C下储存24小时，然后进行蛋白质组学分析、流变测定和脂肪酸组成分析。

凝结魏茨曼氏菌在Minas Frescal干酪的冷藏储存期间（14天，5.26–8.56 log cfu/g）表现出足够的存活率，这与其益生菌状态一致。此外，其添加不影响干酪的组成，水分、蛋白质和脂肪值范围分别为66.3至65.9%、15.3–15.7%和16.1–16.5%。此外，干酪的pH值范围从5.95到6.05。

蛋白质组学分析

蛋白质组学分析根据Scudino等人的方法进行，使用高分辨率基质辅助激光解吸/电离飞行时间（MALDI-TOF）质谱仪（Bruker Daltonics，Bremen，Germany）配备355纳米Nd:YAG激光器。外部校准使用肽标准混合物进行。肽段根据牛奶蛋白质的氨基酸序列[α-、β-和κ-酪蛋白，β-乳球蛋白，α-乳白蛋白和牛血清 albumin（BSA）]进行鉴定。使用Flex Analysis软件（版本3.4，Bruker Daltonics）进行数据处理。

脂肪酸组成

脂肪酸谱使用气相色谱-质谱联用（GC–MS；Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA；型号7890A-5975C）测定，参考Scudino等人的先前研究。脂肪酸的鉴定和定量使用Agilent MassHunter Quantitative Analysis软件进行，结果以脂肪酸总重量的百分比表示。

根据获得的脂肪酸值，计算了一些脂质指数，如血栓形成指数（thrombogenic index，TI）和动脉粥样硬化指数（atherogenic index，AI），按照Bar?owska等人提出的方法。

流变学分析

流变学分析使用TA-XT21质地分析仪（Stable Micro Systems Ltd.，Surrey，UK）进行，配备50公斤负载细胞和35毫米铝板。从干酪中获取圆柱形样品（直径20毫米×长度24毫米），并 individually 用塑料薄膜包裹。

单轴压缩测试通过将样品压缩至其初始高度的80%进行，十字头速度为1毫米·秒^?1。 resulting 力-位移数据转换为真应力（σ，方程1）和真应变（ε，方程2），如Gunasekaran和Ak所述。其中F_t是时间t施加的力，A_t是时间t的横截面积，A₀是初始横截面积，L_t是时间t的样品长度，L₀是初始样品长度，δ是变形。

应力-应变曲线使用五阶多项式方程（方程3）进行拟合，根据Ak和Gunasekaran的方法。计算了以下参数：变形模量（E_D，方程4）、断裂应变（ε_f）和断裂功（W_f，方程5）。

蠕变测试通过向样品施加0.73牛的恒定力进行180秒，在此期间测量变形，并在额外的180秒内监测样品恢复。结果以随时间变化的柔量（compliance）表示，其中柔量对应应变与时间之比与施加的恒定应力（σ₀）的比值（J(t)），数据使用四元件Burger模型通过非线性回归拟合：J(t) = J₀ + J₁(1 - e^?t/τ) + t/η_N（方程6）。J(t)、J₀、J₁、τ和η_N分别是随时间变化的柔量、与Maxwell部分相关的瞬时弹性柔量、与Kelvin–Voigt元件相关的粘弹性柔量、与Kelvin–Voigt元件相关的延迟时间和与Maxwell部分相关的牛顿粘度。

统计分析

实验进行三次重复，所有分析至少进行三次重复。使用单因素方差分析和Tukey检验，显著性水平为P < 0.05。使用XLSTAT 2022.4软件（Addinsoft，Paris，France）进行计算。

结果与讨论

蛋白质组学分析

生物活性肽是通过酶水解或微生物发酵形成的蛋白质片段。它们可以通过与特定受体或酶相互作用来调节生物功能，具有抗菌、抗高血压、免疫调节和其他生物活性效应。然而，并非所有肽都同样表现出这些特性。因此，评估富含益生菌的Minas Frescal干酪的肽谱对于理解添加凝结魏茨曼氏菌如何影响干酪中生物活性肽的产生至关重要。

肽谱分析揭示了三种具有生物活性的肽，这些肽在所有Minas Frescal干酪样品中一致鉴定（表1）。值得注意的是， among 鉴定出的肽是血管紧张素转换酶（ACE）抑制和免疫调节活性。ACE抑制肽通常用于测量抗高血压活性，并被认为是治疗高血压的一种治疗 approach。ACE是一种金属肽酶，催化血管紧张素I转化为血管紧张素II，这是一种有效的血管收缩剂，在血压调节中具有 vital 重要性。抑制ACE导致血管舒张，有助于降低血压和预防心血管疾病。从这个意义上说，它们可以表明添加凝结魏茨曼氏菌的Minas Frescal干酪的生物活性潜力，以促进对心血管和免疫健康的积极作用。

生物活性肽YQEPVLGPVRGPFPIIV（m/z 1881）、LYQEPVLGPVRGPFPIIV（m/z 1994）和LLYQEPVLGPVRGPFPIIV（m/z 2107）均来源于β-酪蛋白，在所有干酪配方中一致检测到， regardless 益生菌补充或浓度。这些肽在文献中 well-documented 具有抗高血压、抗菌、抗血栓和免疫调节特性。它们的持续存在表明它们是由Minas Frescal干酪的蛋白质基质固有产生的。这个过程与固有牛奶酶和干酪加工过程中存活的乳酸菌的协同作用有关。在评估条件下，凝结魏茨曼氏菌补充不影响干酪的肽谱。然而，我们研究小组先前的一项研究发现，补充凝结魏茨曼氏菌的干酪具有增加的生物活性（P < 0.05），尤其是当样品呈现较高剂量时。这种效应归因于增强的蛋白水解，因为这种孢子形成益生菌具有使用牛奶蛋白质作为底物的蛋白酶，能够产生肽和游离氨基酸。

因此，尽管一些肽在所有干酪中都被鉴定出来，但在添加凝结魏茨曼氏菌的干酪中观察到的更高生物活性可能是干酪基质和益生菌培养物的酶活性之间的 combined 作用。从这个意义上说，我们的研究结果表明凝结魏茨曼氏菌具有作为开发功能性乳制品，特别是具有增强生物特性的干酪的技术策略的有趣潜力。

流变特性

图1(a)显示了Minas Frescal干酪样品的真应力-真应变曲线，表2显示了拟合五阶多项式方程后的估计参数。

对照样品表现出最低值，而益生菌补充样品具有更突出的曲线。变形模量（E_D）反映了材料抵抗轴向变形的能力，可以解释为其刚度，从应力-应变曲线的初始线性段获得。益生菌样品表现出显著更高的E_D值（43.9–48.4千帕） compared 对照样品（32.6千帕）。这些结果表明添加益生菌培养物显著增加了干酪的刚度。

断裂应变（ε_f）和断裂应力（σ_f）是 essential 机械参数，提供了关于干酪在破裂前的结构完整性和机械行为的宝贵见解。这些指标与显著影响质地和感官属性的各种干酪特性相关。通常，断裂应变与脆性呈现相反关系，而断裂应力与硬度成正比。然而，本研究观察到干酪样品在断裂应变方面具有相似行为（P < 0.05），表明凝结魏茨曼氏菌的添加对干酪脆性影响很小。然而，益生菌干酪呈现出更高的断裂应力值（16.7–17.3千帕） compared 对照样品（7.86千帕），在益生菌剂量方面没有观察到差异（P > 0.05）。这些结果表明添加益生菌培养物有助于更硬的干酪，提供更大的抗断裂性。类似地，断裂功（W_f），代表破裂干酪基质所需的能量，遵循相同的趋势。对照样品表现出最低的W_f值，而益生菌样品显示出显著更高的值。这些结果表明含有凝结魏茨曼氏菌的干酪需要更多能量来断裂，表明增强的结构完整性。

在Minas Frescal干酪中观察到的变形模量、断裂应力和断裂功的增加可归因于几个因素。这些因素包括增强的蛋白质交联、由于增加的酶活性而改善的质地、增加的水分保留、改变的微生物代谢物、pH和酸度的变化、菌株特异性效应以及与 starter 培养物的潜在协同作用。虽然这些机制可以 collectively contribute 干酪质地的改善，但它们的相对重要性可能有一个范围，这与益生菌菌株和干酪制作过程有关。需要进一步研究来评估和确认在这种背景下的确切机制。

图1(b)显示了Minas Frescal干酪样品随时间变化的柔量（J(t)）曲线。在CONT样品中观察到增加的柔量值，表明在恒定应力下对时间依赖性变形的 susceptibility。相反，益生菌干酪样品（QI、QII和QIII）表现出较低的柔量值，表明对变形的 elevated 结构抵抗力。研究结果表明添加凝结魏茨曼氏菌影响干酪的粘弹性行为，导致更硬、更稳定的基质。这一事实通过从将数据拟合到四元件Burger模型得出的流变参数得到证实（表2），该模型提供了样品粘弹性行为的评估，提供了在蠕变测试期间其变形行为和时间依赖性机械响应的见解。

瞬时弹性柔量（J₀）代表材料对变形的立即响应，并与材料刚度成反比。益生菌干酪样品的J₀值 compared 对照样品增加（7.71–9.58 × 10^?7 Pa^?1 对 2.76 × 10^?7 Pa^?1，P < 0.05），表明初始刚度降低。粘弹性柔量参数（J₁）定义为在恒定应力下随时间变化的变形。对照样品中显著更高的J₁值（5.96 × 10^?5 Pa^?1）表明非益生菌样品更具粘弹性，并在持续应力下随时间继续变形。相反，益生菌培养样品中较低的J₁值（4.50–4.71 × 10^?5 Pa^?1）表明 somewhat less prone 连续变形。

延迟时间（τ）是衡量材料在经历变形后放松并返回其原始形状所需时间的度量。它提供了关于材料的时间依赖性机械行为和质地的宝贵见解。在本研究中，τ值范围从3.32到4.06秒，样品之间没有显著差异。这些 moderate 值（τ）表明所有Minas Frescal干酪配方表现出平衡的粘弹性响应，能够适应应力而不会过快或过慢的松弛。这种机械行为有助于Minas Frescal干酪的理想质地，将硬度与 characteristic smoothness 结合。

牛顿粘度（η_N）表示材料在受到剪切力（如涂抹或倾倒）时的流动阻力，反映了其行为。益生菌干酪样品表现出更高的η_N值 compared 传统干酪（4.42–6.04 × 10⁶ Pa·s 对 4.00 × 10⁶ Pa·s， respectively，P > 0.05）。并且η_N的增加与益生菌剂量成正比。这种行为表明添加凝结魏茨曼氏菌导致干酪具有更大的流动阻力，导致 reduced spreadability 和更硬、更内聚的质地。

总体而言，向Minas Frescal干酪中添加凝结魏茨曼氏菌产生了显著的流变学和质地益处。这些益处包括发展出更硬的质地，这可能吸引寻求固体、 less 易碎一致性的消费者。这些质地改善可能源于干酪基质内增强的蛋白质结构和酶活性。这些增强不仅有助于更好的感官体验，还提供了市场分化的机会，因为消费者 increasingly 寻求具有独特质地和潜在健康益处的产品。

脂肪酸组成

Minas Frescal干酪样品（CONT、QI、QII和QIII）的脂肪酸组成，以及脂质指数、动脉粥样硬化（AI）和血栓形成（TI）指数，总结在表3中。观察到中链脂肪酸的存在，包括己酸（C6:0）、辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）和十二酸（C12:0），以及长链脂肪酸，如肉豆蔻酸（C14:0）、肉豆蔻烯酸（C14:1）、十五酸（C15:0）、棕榈酸（C16:0）、棕榈烯酸（C16:1）、十七酸（C17:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1n9c）、反式亚油酸（C18:2n6t）和亚油酸（C18:2n6c）。

总体而言，干酪样品表现出中等浓度的中链脂肪酸和较高浓度的长链脂肪酸，包括肉豆蔻酸（C14:0）、棕榈酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）和油酸（C18:1n9c）。这些结果与先前的研究一致，因为这些脂肪酸在乳制品中常见，并且对于评估其营养品质和健康特性 important。短链和中链脂肪酸在调节细胞代谢中起着 vital 作用。它们还作为细胞内信号通路的关键介质，直接影响 essential 生理和生化功能。然而，过量摄入长链饱和脂肪酸，如棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0），与消费者健康的负面方面相关，导致更高的体脂肪、 elevated 炎症标志物、加重的胰岛素抵抗风险和2型糖尿病的发生。

尽管各种脂肪酸的浓度在所有干酪配方中相似，但添加凝结魏茨曼氏菌改变了脂质谱 compared 传统干酪。事实上，注意到与对照样品相比，存在更高水平的中链和长链饱和脂肪酸（P ≤ 0.05）也改善了不饱和脂肪酸，包括单不饱和（MUFA）和多不饱和（PUFA）值，这种效应与益生菌剂量成正比，在QIII中观察到最高值，其次是QII和QI（P < 0.05）。益生菌干酪中脂肪酸不饱和度的增加反映了微生物对环境压力的普遍保守适应响应。这种转变通常与维持膜流动性和功能性的需要相关。MUFA天然存在于乳制品中，与降低代谢综合征、心血管疾病风险和其他健康促进特性相关。反过来，PUFA在维持和促进健康以及预防各种慢性疾病中起着 essential 作用。由于人体无法合成这些脂肪酸，强烈推荐膳食摄入。

为了更好地理解反映心血管疾病潜在发作的参数中的脂肪酸组成，计算了动脉粥样硬化（AI）和血栓形成（TI）指数。益生菌干酪样品的AI值 compared 传统样品更低（1.74至1.85对1.91， respectively P < 0.05）。关于TI，QI处理与对照相似（2.88和2.93， respectively；P > 0.05），而QII和QIII显示出显著更低的值（2.78和2.69， respectively；P < 0.05）。这些结果表明添加凝结魏茨曼氏菌，特别是在较高浓度（QII和QIII）下，可以改善Minas Frescal干酪的健康状况，并加强将这种益生菌菌株添加到该产品中的益处。

结论

向Minas Frescal干酪中添加凝结魏茨曼氏菌GBI-30增加了生物活性肽的产生，并改善了脂肪酸组成。这些发现突出了新鲜干酪作为补充孢子形成益生菌的 adequate 食品基质的固有潜力。

此外，凝结魏茨曼氏菌的存在 positively 影响干酪的流变学和质地特性，促进更硬、更内聚的结构。从技术和感官角度来看，这些改善可能为新鲜干酪增加价值，并与消费者对提供健康益处和理想质地和口感的 functional 食品的需求保持一致。考虑到本研究中获得的所有发现和经济原因，在Minas Frescal干酪中添加6 log cfu/g的凝结魏茨曼氏菌GBI-30是最合适的选择。该剂量提供了相似的脂质指数和具有不同生物活性的生物活性肽的存在，并导致了相似的流变学参数。

建议进一步研究以评估感官接受度，并使用体内模型或临床试验验证益生菌Minas Frescal干酪的健康相关声称。