细胞通讯网络因子2（CCN2）核转位与PU.1互作调控纤维化相关基因表达的新机制及其在器官纤维化中的意义

《Journal of Cell Communication and Signaling》：Interaction between nuclear-translocated cellular communication network factor 2 and purine-rich box 1 regulates the expression of fibrosis-related genes

本文揭示了细胞通讯网络因子2（CCN2）通过其核定位信号样肽段转位至细胞核，与转录因子嘌呤丰富框1（PU.1）相互作用，形成转录复合物，协同上调肾素-血管紧张素系统（RAS）组分及纤维化标志物（如Col1a1、Acta2）的表达，为靶向细胞内CCN2-PU.1通路治疗纤维化疾病提供了新视角。

　　

1 引言

纤维化是一种因器官和组织损伤后愈合过程失控而导致过量纤维结缔组织积累的疾病，最终导致器官功能丧失。肌成纤维细胞的分化是纤维化进程的核心环节，但其调控机制尚未完全明确。嘌呤丰富框1（PU.1）作为转录因子，近期被发现在促纤维化系统中扮演关键角色。细胞通讯网络因子2（CCN2）是CCN家族成员之一，作为基质细胞蛋白，在细胞外微环境中协调多种细胞功能，并在病理条件下参与纤维化的发生与发展。值得注意的是，CCN2不仅含有N端信号肽，其C端附近还存在一个富含赖氨酸和精氨酸的核定位信号样（NLS-like）肽段，提示其可能具备核转位能力并发挥细胞内功能。然而，CCN2核转位及其在纤维化中的作用仍不清楚。本研究旨在探究CCN2在成纤维细胞核内的转位现象，及其与PU.1相互作用对纤维化标志物表达的调控作用。

2 材料与方法

研究采用小鼠胚胎皮肤成纤维细胞NIH3T3作为模型细胞系。通过基因转染技术，分别构建并表达了携带HA标签的全长小鼠Ccn2基因（pCCN2-HA）、Flag标签的小鼠Spi1基因（pFlag-Spi1，编码PU.1）、以及含有CCN2的NLS样肽段的GST融合蛋白（pFlag-GST-NLS）和对照GST蛋白（pFlag-GST）。采用间接免疫荧光和Western blot技术分析CCN2及融合蛋白的亚细胞定位。通过染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR和电泳迁移率变动分析（EMSA）检测CCN2与Spi1基因调控区域的直接结合。利用免疫共沉淀（IP）-Western blot验证CCN2与PU.1的物理相互作用。通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）和Western blot分析纤维化相关基因（如Col1a1、Acta2）及肾素-血管紧张素系统（RAS）组分（如Ace1、Agtr1、Agtr2）的表达变化。使用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血管紧张素II（ANG II）的产量。统计学分析采用Bonferroni检验和Student t检验。

3 结果

3.1 CCN2在NIH3T3细胞中发生核转位

免疫荧光分析显示，在过表达CCN2-HA的NIH3T3细胞中，CCN2部分定位于细胞核内。Western blot进一步证实，在细胞核和细胞质组分中均能检测到CCN2蛋白。为探究NLS样肽段的功能，研究发现携带该肽段的GST融合蛋白（GST-NLS）可在核内检测到，而对照GST蛋白仅存在于细胞质中，表明CCN2的NLS样肽段能以顺式作用方式介导蛋白质核转位。

3.2 CCN2核转位上调Spi1表达

qRT-PCR分析显示，过表达CCN2能显著上调Spi1的基因表达水平。ChIP-PCR分析发现，CCN2特异性结合于Spi1基因启动子近端保守调控区域，而非远端区域。EMSA实验进一步证实，重组CCN2蛋白（rCCN2）可与该近端区域探针结合，形成特异性条带，该结合可被未标记探针竞争性抑制，且该条带经抗体验证含有CCN2蛋白。

3.3 CCN2在核内与PU.1相互作用

免疫荧光显示，在同时过表达CCN2和PU.1的细胞中，两者在核内共定位。IP-Western blot分析证实，在核提取物中，利用抗PU.1抗体可共沉淀出CCN2蛋白，表明两者存在物理相互作用。此外，与单独过表达CCN2相比，共表达PU.1能促进CCN2向核内转位。

3.4 CCN2与PU.1共表达调控RAS组分及纤维化标志物

同时过表达CCN2和PU.1能显著上调血管紧张素转换酶1（Ace1）及血管紧张素II受体（Agtr1、Agtr2）的基因表达，并促进ANG II的蛋白产量。此外，纤维化标志物基因Col1a1和Acta2的表达也显著上调，且该上调效应可被血管紧张素II受体I阻断剂氯沙坦所抑制。在蛋白水平上，同时过表达CCN2和PU.1能协同增加Ⅰ型胶原和α-SMA的产量，而对CCN2和PU.1本身的蛋白水平无叠加效应。

4 讨论

本研究首次证实CCN2可在成纤维细胞中转位至细胞核内，并作为转录共因子与PU.1相互作用，形成复合物，共同调控纤维化相关基因的表达。核内CCN2直接结合于Spi1基因的保守调控区域，上调其表达，进而形成正反馈环路，放大促纤维化信号。尤为重要的是，CCN2-PU.1复合物通过上调RAS关键组分Ace1的表达，促进ANG II生成，进而激活ANG II受体信号，最终导致Col1a1和Acta2等纤维化标志物的表达增加。这一发现揭示了CCN2除经典胞外功能外，作为一种细胞内因子（intracrine factor）在核内调控基因转录的新机制。近期抗CCN2单抗FG-3019（Pamrevlumab）在特发性肺纤维化（IPF）III期临床试验中未达预期疗效，提示靶向胞外CCN2可能不足以遏制纤维化进程，而靶向核内CCN2-PU.1相互作用或许为治疗纤维性疾病提供了新策略。

5 结论

本研究阐明CCN2可通过其NLS样肽段转位至细胞核内，与PU.1相互作用，形成转录复合物，协同上调RAS组分及纤维化相关分子的表达，从而促进纤维化进程。这些发现不仅拓展了对CCN2生物学功能的认识，也为开发靶向细胞内CCN2-PU.1通路的新型抗纤维化疗法奠定了理论基础。