细胞色素c在羧基化表面的吸附：表面曲率调控的电荷分布与蛋白质定向

《Nanoscale》：Cytochrome c adsorption on carboxylated surfaces: charge regulation and protein orientation modulated by surface curvature

纳米级曲率调控电荷调节聚合物刷对细胞色素c吸附的影响及电子转移机制研究。通过分子理论框架结合粗粒度模型，系统分析曲率、pH、盐浓度及氧化态对吸附能量和取向的影响，发现曲率改变吸附距离和蛋白取向，增强表面负电性及蛋白质质子化协同调控，解释了曲率纳米结构中电子转移增强现象，为生物纳米电极设计提供理论依据。

　　蛋白质与表面的精确控制是设计功能性混合纳米材料的关键。纳米尺度的曲率，尤其是在聚合物包覆的粒子上，可以显著调节聚合物行为和表面特性，从而改变蛋白质的吸附方式。以往关于细胞色素c（cytC）吸附的研究主要集中在平面表面上，而对纳米曲率、电荷调节的聚合物刷以及蛋白质的取向和氧化状态之间的协同作用则较少关注。本研究通过分子理论结合粗粒化模型，系统地量化了曲率、pH值和盐浓度对cytC在羧基终止的聚合物刷表面吸附行为的影响。结果表明，cytC的氧化状态决定了其取向，但并不影响吸附能量。电荷调节在这一过程中起着至关重要的作用：当蛋白质接近刷子时，赖氨酸和组氨酸残基会质子化，而聚合物则会去质子化，这种协同响应受到pH值和离子强度的调控。曲率还改变了蛋白质与表面之间的平衡距离，并调节血红素基团的取向。这些发现不仅解释了之前关于曲率纳米结构中电子转移增强的观察结果，还为利用曲率作为设计工具，在基于纳米颗粒的电极和催化剂中实现功能化提供了实用的指导和机制框架。

纳米材料在多个领域中发挥着重要作用，如电子学、能源、环境修复和生物医学等。蛋白质的吸附行为在这些应用中具有关键意义，因为它能够提升生物传感器、药物递送载体和催化剂的性能，但若不受控则可能导致生物污垢，产生相反的效果。虽然已有大量研究关注蛋白质在平面聚合物修饰表面的吸附，但对其在纳米曲率表面，如纳米颗粒和纳米纤维上的行为了解仍较为有限。许多纳米颗粒通过聚合物刷进行包覆，以增强其稳定性和生物相容性。曲率改变了聚合物链的构象自由度和堆积密度。实验和理论研究表明，这些刷子的电离程度会随着pH值、盐浓度和曲率的变化而改变，特别是在高度曲率的表面上，自由体积的增加可以将表观的pKa值移动高达两个pH单位。这种由曲率引发的电荷调节强烈影响了蛋白质对局部电场的感知和响应。此外，纳米曲率已被证明可以调节蛋白质在表面的取向，从逐渐的取向变化到pH依赖的重新取向。因此，对这些效应的分子层面理解对于设计具有定制蛋白质相互作用的纳米材料至关重要。这些曲率效应在系统尺寸接近生物分子大小时变得尤为重要。本研究通过聚焦于不同曲率表面的cytC吸附行为，以填补这一知识空白。

cytC是线粒体呼吸过程中关键的电子转移（ET）蛋白，其紧凑且相对刚性的结构、已知的红ox特性以及广泛的实验和计算文献，使其成为研究蛋白质-表面相互作用的绝佳模型，即使在刚体近似下也是如此。此外，明确cytC的吸附机制对于设计功能化的生物界面、电化学传感器和生物催化系统具有直接意义。在平面的羧基自组装单层（SAMs）上，当蛋白质发生旋转时，异质ET速率会急剧下降。分子模拟显示，取向通过调节电子耦合和局部介电环境来影响ET，而经典ET理论则预测了其与距离的指数关系。溶液条件如pH值和离子强度也可以调控吸附行为。然而，大多数详细研究仍然集中在平面表面上。在金纳米星的实验中，其尖端半径仅为几纳米，结果表明cytC吸附后ET反应被促进，但其分子机制仍不明确。

以往关于cytC在平面表面吸附的研究，对纳米曲率如何重塑这一过程缺乏深入理解，尤其是在考虑电荷调节的聚合物刷和长程静电相互作用的情况下。如前所述，这类刷子的电离程度可以在高度曲率的表面上移动多达两个pH单位，而蛋白质本身也会根据其接近带电界面的情况调整其质子化状态。然而，如何将这两种电荷调节机制结合起来，影响cytC的吸附距离和取向，仍然是一个未解的问题。cytC的多种氧化状态增加了复杂性，因为红ox转换会重新分配电荷并调节吸附能。填补这些知识空白对于构建对纳米颗粒表面蛋白质行为的预测性图景，以及设计具有定制特性的生物界面至关重要。

本研究通过使用分子理论框架，结合粗粒化模型，系统地探讨了曲率、刷子电离度和蛋白质氧化状态对cytC吸附的耦合效应。在概述了理论框架和模型参数后，我们首先在平面的羧基层上进行了基准测试，然后扩展到曲率逐渐减小的曲面。我们分析了曲率、pH值、盐浓度和红ox状态如何塑造蛋白质的吸附自由能景观、电荷调节和最佳取向。最后，我们讨论了观察到的曲率依赖的电荷调节和蛋白质取向趋势，为理性设计生物电极和其他纳米-生物界面提供了机制基础，强调了曲率作为基本设计参数的重要性。

在理论框架中，我们采用了一种分子理论（MOLT），该理论明确考虑了系统的结构细节、大分子（聚合物和蛋白质）的构象自由度以及分子物种的化学平衡。以往的研究已经证明，这种方法在研究蛋白质与表面相互作用时具有准确性。理论的第一步是写出一个三维半大统势函数Ω(T, V, N_pol, μ_j)，其中T是系统的温度，V是体积，N_pol是固定在表面的聚合物链数量，μ_j是移动物种（阴离子、阳离子、质子和氢氧根）的化学势。方程（1）展示了该势的不同项，其中k_B是玻尔兹曼常数，β = 1/(k_B T)。第一项表示所有移动物种的平动熵，第二项S_conf考虑了端接聚合物链的构象熵，第三项F_electr捕捉了系统中的静电相互作用。F_pol_chem和F_prot_chem分别对应于聚合物和蛋白质酸碱平衡的焓贡献，使我们能够显式地考虑蛋白质和表面单体的可电离氨基酸的酸碱反应。最后一项βN_j μ_j代表了所有移动物种的格拉姆-康奈尔贡献。在这一描述中，蛋白质的位置和取向是固定的，因此我们假设移动物种和聚合物链可以瞬时适应蛋白质的位置。方程（1）中各项的显式表达可以在我们之前的一项研究中找到，该研究探讨了通过弱聚电解质修饰的纳米孔中不同蛋白质的转运行为。

为了解决该理论，我们需要首先获得半大统势函数βΩ的函数极值，涉及多个未知变量：所有移动物种的密度ρ_i(r)、氨基酸和聚合物酸性段的电荷分布，以f_prot_j(r)和f_pol(r)表示，其中f_prot_j(r)代表吸附蛋白质中氨基酸j的电荷度，f_pol(r)代表表面聚合物在位置r处的电荷度；系统的静电势ψ(r)；以及找到给定聚合物链j在构象α的概率P_j(α)。由于这些表达式的耦合，无法获得解析解，因此我们采用了无雅可比矩阵的牛顿法，并将系统离散化为三维网格。解决理论所需的输入包括系统的分子和化学细节，这些细节在以下部分进行描述。输出包括系统的分子组织（所有移动物种的局部密度和聚合物不同构象的概率）、静电势、所有可电离物种的化学状态（质子化/去质子化），以及最重要的，固定蛋白质位置和取向时的系统自由能。感兴趣的读者可以参阅参考文献29以获得更多细节。

为了解决该理论，我们需要明确系统中表面（形态、曲率、表面功能化）、浴液溶液、聚合物和蛋白质模型的细节。为了研究曲率对蛋白质吸附过程的影响，我们分析了平面表面或球形表面（纳米颗粒）上cytC的吸附行为，其中纳米颗粒的半径为R_NP = 1, 3, 5, 7.5, 10 nm（见图1A）。在所有情况下，表面被功能化为每链16个中性段和一个终端可电离的酸性段，使得所有系统的表面密度相近，为4.67–4.55个聚合物链每nm2，与金-自组装单层（Au-SAMs）的报道值相似。由于系统几何结构的不同，这导致了计算盒的大小和表面上总聚合物数量的差异。这些细节可在补充信息（SI）的表S1中找到。

为了模拟表面的聚合物，我们采用了一种粗粒化方案，其中聚合物序列由16个中性段和一个末端可电离的酸性段组成，类似于16-巯基十六烷酸。所有链段的体积被设定为0.027 nm3，而电荷为0或-1，分别对应于中性/质子化或去质子化组。酸性组的pKa为4.8，这与溶液中的理想单体相对应。通过将聚合物连接到平面表面所得到的单层的物种图（见图S1）和在结果部分讨论的电荷调节机制有关。聚合物的介电常数被设定为3.0，以表示中性链的行为。为了描述表面的聚合物，我们需要生成代表性的构象集合。为正确表示链的构象，我们在每个表面接枝位置使用了100,000个随机生成的聚合物构象，这些构象通过0.153 nm的段长（参考文献11）和旋转等距状态（RIS）创建。仅考虑不与表面或蛋白质重叠的构象。值得一提的是，每个几何结构的链构象集合是单独生成的，并用于所有相应的计算。

为了模拟蛋白质与表面的相互作用，我们需要定义浴液溶液的盐浓度和pH值。在我们的计算中，这些参数通常固定为10 mM和7，除非另有说明。所有移动物种的体积和电荷在补充信息的表S2中给出，而溶剂的相对介电常数在整个系统中被设定为78.54。

蛋白质结构来源于蛋白质数据银行（PDB），我们采用了文献中报道的cytC在氧化态和还原态下的结构。具体而言，氧化态cytC的结构为PDB ID：1HRC，而还原态cytC的结构为PDB ID：1GIW。这些结构被选择，因为它们代表了马匹心脏细胞色素c在氧化态和还原态下的最高分辨率结构，并且在文献中被广泛用作参考模型。

在我们的计算中，蛋白质被当作一个刚体处理，其所有氨基酸位置相对于蛋白质的质心是固定的。因此，我们没有考虑蛋白质吸附在不同表面时的构象变化。这种近似通常适用于pH 4到9之间；在该范围之外，氧化态cytC会发生构象变化。此外，几项光谱研究报道了在该pH范围内，细胞色素c在羧基化SAMs上保持天然折叠。为了评估取向对蛋白质行为的影响，我们在每个位置上对蛋白质进行了864次旋转。

我们采用了一种粗粒化模型来表示蛋白质，其中每个氨基酸由两个固体球表示：一个用于主链，一个用于侧链，除了甘氨酸，它仅用一个主链球表示，与之前的工作类似。根据氨基酸的性质，侧链可以是中性或可电离的。所有可电离氨基酸的平衡常数可在补充信息的表S3中找到。此外，我们还需要对血红素组进行粗粒化，将其视为铁原子、丙酸基团、吡咯环和乙基基团等不同的球体（见图S2），每个球体都有自己的体积和电荷（见表S4）。

关于聚合物和蛋白质模型的更多细节可在补充信息中找到。

在结果和讨论部分，我们探讨了cytC与不同曲率的聚合物修饰表面之间的相互作用，重点分析了曲率、红ox状态、pH值和盐浓度如何影响吸附过程。这些表面被覆盖了一种弱电解质刷，其表面密度为4.55–4.67条链每nm2。聚合物链在表面上均匀分布，由16个中性段和一个终端可电离的酸性段组成。系统包含一个固定距离的cytC分子，浸泡在溶剂分子（水）和离子（OH?、H?、阳离子和阴离子）的储库中。对于每项计算，我们指定了浴液溶液的pH值和盐浓度作为输入参数。蛋白质的模型采用粗粒化方法，如图1B所示。

为了更深入地理解驱动吸附过程的相互作用，我们研究了系统各种参数对自由能的影响。我们探讨了cytC的红ox状态、浴液溶液的pH值和盐浓度以及表面曲率的影响。在所有情况下，我们计算了自由能景观作为蛋白质与表面距离的函数，同时对864种不同的蛋白质取向进行采样，以确定每个位置的最佳配置。我们假设蛋白质的平动和旋转时间尺度比系统中小离子和聚合物的平衡时间尺度慢，这与之前应用该理论框架对蛋白质和纳米颗粒的转运研究一致。基于这一假设，我们可以在固定蛋白质位置和取向的情况下分析系统的自由能。

在本研究中，我们发现，蛋白质的氧化状态对吸附过程的取向偏好具有显著影响。在考虑的pH条件下，系统自由能曲线显示在距离表面约3.75 nm处出现一个最小值，表明蛋白质的吸附。这种行为源于蛋白质与表面刷之间的吸引静电相互作用。在氧化态和还原态下，自由能曲线的深度和最小值位置非常相似。在远离表面的距离（d > 10 nm）时，自由能逐渐趋于常数值，这是由于蛋白质与表面之间的距离增加，相互作用减弱。

在远离表面的区域，蛋白质与刷子之间的相互作用可以忽略不计，此时总能量近似为孤立组分的总和。这种非相互作用状态被用作自由能为零的参考点。当蛋白质接近表面时，蛋白质与酸性刷之间的静电相互作用变得显著，这种相互作用依赖于蛋白质和刷子的电荷状态，因此受到浴液溶液的pH值和盐浓度的影响。

在考虑的pH值（pH = 7）下，聚合物刷部分电离（约25%），赋予表面涂层负电荷（见图S1）。相比之下，蛋白质带有正电荷，因为pH值低于细胞色素c的等电点（pI = 10.2–10.5）。这种情况下，蛋白质与表面之间的吸引静电相互作用会降低系统的自由能。然而，当蛋白质距离表面小于最小值时，蛋白质与刷子之间的空间排斥作用变得主导，导致系统自由能突然上升。

关于蛋白质取向的影响，我们观察到随着蛋白质接近表面，其取向对吸附过程的影响逐渐增强。这在图中通过垂直线来体现，这些线表示在固定距离下不同蛋白质取向对应的自由能范围。这种广泛分布源于蛋白质电荷分布的异质性，这是由于其不同可电离氨基酸的位置和质子化状态所导致的。图2B展示了在自由能最小值处，每种氧化状态下最有利的取向。尽管氧化态和还原态的自由能曲线在所有取向下的平均自由能（图2A中的中心标记）非常相似，但我们确实观察到了蛋白质在吸附后获得的取向之间的显著差异，表明最稳定的取向强烈依赖于其氧化状态。有趣的是，所有取向中最低自由能值（图2A中的垂直条底部）在氧化态下更低。这一观察结果与之前基于分子力学/广义出生面积（MM/GBSA）计算的计算结果一致。

为了准确描述蛋白质在表面的取向，我们定义了两个旋转角度：α，血红素基团的倾斜角，测量主链中的Fe–S_Met80键与表面法向量（Z轴）之间的夹角；?，表示血红素绕其自身轴的旋转。图S4（SI）中提供了这些角度的详细说明和可视化表示。对于两种红ox状态，最有利的取向将血红素口袋朝向表面（见图2B），与? ≈ 190°一致。然而，血红素的倾斜角存在显著差异：在氧化态下，血红素的倾斜角为α ≈ 130°，而在还原态下，它几乎垂直于表面，为α ≈ 80°。此外，尽管氧化态表现出一个明确的最小值，但还原态的cytC在多个取向下具有相似的自由能值，表明在室温下，这些配置可能是热力学可及的。这在图S5的顶部行中得到了支持，并与之前分子动力学研究中报告的类似取向灵活性一致。

为了进一步验证我们的结果，我们将预测的氧化态cytC最稳定取向下赖氨酸残基的表面接近程度与实验数据（差分甲基化实验）进行了比较。预测的最接近表面的赖氨酸残基与吸附后甲基化反应性降低的残基匹配，而更暴露的残基则相反（见表S5）。这支持了我们对取向预测的准确性。此外，我们的结果还表明，静电相互作用和空间排斥作用足以准确描述cytC在修饰表面的吸附行为。尽管依赖于刚体近似，我们的模型成功地再现了实验观察和分子动力学模拟中的一些关键特征，包括优选取向、吸附自由能和残基级别的可及性模式。

最后，我们分析了铁的红ox状态对观察到的重新取向的具体贡献。我们进行了额外的计算，使用混合模型：氧化态结构（1HRC）与亚铁血红素铁，以及还原态结构（1GIW）与高铁血红素铁。如图S5的底部行和图S6所示，这些混合模型的优选取向和自由能曲线与原始结构非常接近，表明重新取向并非仅由血红素铁的正式电荷驱动，而是反映了表面电荷分布和血红素口袋周围局部重排的细微差异。

电荷调节机制和蛋白质取向对吸附过程的影响在本研究中得到了深入探讨。图2A显示，在距离表面约10 nm时，系统的自由能开始下降，这与接近相反电荷的情况相符。随着蛋白质接近表面，其与表面之间的静电相互作用变得显著，这些相互作用受到蛋白质和刷子电荷状态、浴液溶液的pH值和盐浓度的影响。我们还观察到，蛋白质的电荷随着其接近表面而发生变化，变得比在溶液中更正。这在图3A中有所体现。如图所示，蛋白质的红ox状态对电荷变化影响较小。由于蛋白质和单层都含有可电离的基团（氨基酸和酸性段），它们会根据溶液条件调节电荷，以优化这些静电相互作用。这种调节是通过改变酸碱平衡，以牺牲化学自由能来实现的。电荷调节机制已被描述用于蛋白质和聚合物刷，并且我们希望深入分析其对本研究系统中蛋白质吸附的影响。在pH = 7.0的条件下，表面单层带有负电荷，促进cytC中可电离氨基酸的质子化，这取决于蛋白质的取向，因为取向决定了每个氨基酸与表面的距离。这在图3中通过每个点的垂直线体现，这些线表示在固定距离下不同蛋白质取向对应的自由能值的分布。我们还可以在图3B中观察到这一现象，其中我们绘制了系统自由能随吸附蛋白质电荷的变化曲线。如图3A所示，蛋白质在吸附后会增加其正电荷，从而增强与负电荷表面的静电吸引（见图S7A）。

这种现象在距离表面5–6 nm处更为明显，该距离与10 mM KCl溶液中平面带电表面的德拜长度（3.04 nm）和表面单层厚度（约2 nm）相符。电荷调节现象已被描述用于蛋白质在带电表面附近的相互作用，以及通过修饰纳米孔的蛋白质转运过程。在这种情况下，蛋白质接近表面时也会发生电荷调节。对于平衡距离，蛋白质的电荷略有增加，从而增强其与负电荷表面的静电吸引。然而，当蛋白质距离小于平衡距离时，空间排斥作用主导，导致自由能急剧上升。进一步的电荷优化需要涉及更多的氨基酸，但由于它们的pKa值与pH值（7.0）不匹配，这种优化将带来高昂的能垒。

电荷调节也在表面单层中发生，具体表现为两个方向的改变。首先，由于单层中酸性段是聚合物的一部分，且具有特定的表面密度，其酸碱平衡会发生变化。这在图S1中有所体现，其中我们看到理想酸性单体在溶液中的滴定曲线在表面单层中几乎向更高pH值移动了3个单位，导致表面单层的表观pKa值约为7.8，与溶液中单体的4.8相比。对于表面单层，由于相同电荷的头部基团之间的静电排斥，系统会向质子化（和中性）状态转移。这种转移的幅度与表面聚合物的高接枝密度（4.55条链每nm2）有关。类似的结果在平面刷中也已被观察到。第二个电荷调节机制在蛋白质接近表面时发挥作用（见图S7）。在这种情况下，根据浴液溶液的pH值，蛋白质会携带正电荷或负电荷，从而产生吸引或排斥的相互作用。然后，表面单层会根据浴液的pH值上调或下调酸性段的去质子化程度（见图S7）。

到目前为止，我们已经分析了蛋白质作为一个整体的电荷，但实际上蛋白质具有空间电荷分布的各向异性，这使得取向在许多过程中成为一个关键因素。图3B反映了这一点，显示了氧化态cytC在平衡距离下随取向变化的自由能。我们看到蛋白质的总电荷与自由能之间没有明显相关性（还原态cytC的结果可在图S8B中找到）。这表明更正的净电荷并不一定意味着更强的对负电荷表面的亲和力。为了深入理解这一点，我们强调净电荷代表了正负电荷的总和，这突显了正电荷取向对表面的相对重要性。

为了进一步探索不同取向相对于带电表面的偏好，我们研究了自由能与吸附蛋白质的偶极矩之间的关系。这种方法已被用于分析蛋白质在修饰纳米孔中的相对取向，显示出强相关性和良好的描述性。氧化态cytC的结果总结在图4中（还原态cytC的结果可在图S8中找到）。

在图4A中，我们看到，对于吸附的cytC，最稳定的取向对应于偶极矩矢量指向带电表面，而最不稳定的取向则指向远离表面（蛋白质的质心用绿色球体标记）。每个箭头从负电荷指向正电荷。空间排列可以再次通过考虑在pH = 7.0的条件下，表面单层的负电荷以及其电荷组在平面上的排列来解释，从而产生静电势ψ（见图4B）。根据图4C和图4D，我们发现，在xy平面和轴向方向上，自由能与偶极矩之间存在不同的相关性。对于还原态cytC，我们观察到相似的定性行为，蛋白质优选以偶极矩指向表面的取向。尽管偶极矩近似可能过于简化，无法准确描述蛋白质复杂的电荷分布，但它仍然能够捕捉和解释吸附过程中的主要特征。

表面曲率对蛋白质吸附的影响是通过其对电荷调节机制的影响而实现的。图7展示了氧化态cytC在不同半径的纳米颗粒表面吸附时的净电荷（图7A）和聚合物刷中酸性段的解离分数（图7B）随距离表面的变化。这些结果表明，随着纳米颗粒的曲率变化，蛋白质的净电荷和酸性段的解离程度也会发生相应的变化。这种化学通信在吸附过程中高度依赖于蛋白质的等电点、单层的pKa、溶液的pH值及其离子强度。通过调节pH值和盐浓度，cytC可以被吸附或从表面脱附。

由于蛋白质内部电荷分布的各向异性，其相对于表面的取向在吸附过程中也起着关键作用。使用蛋白质偶极矩作为局部电荷分布的代理，我们的计算表明，最稳定的取向倾向于沿着指向表面的锥体排列。

最后，表面曲率通过影响系统的分子组织和电荷调节机制，对蛋白质吸附产生了显著影响。随着纳米颗粒变大，聚合物刷会进一步延伸到溶液中，从而增加蛋白质与表面之间的平衡距离，同时旋转cytC的血红素边缘。对于cytC来说，这些由曲率驱动的距离和取向变化不仅仅是结构上的，因为异质ET速率对距离和红ox活性位点与表面的相对排列高度敏感。因此，计算出的趋势为曲率金纳米结构中增强的ET活性提供了机制联系，并为利用基于细胞色素的红ox化学的纳米颗粒电极和催化平台提供了具体的设设计规则。

未来的研究将扩展当前的分子理论框架，以涵盖那些吸附主要由疏水或分散力主导的蛋白质，或者那些净偶极矩较弱的蛋白质，以测试在缺乏强静电相互作用的情况下，曲率控制的空间限制是否仍能引导取向。