DMPO捕获DNA自由基减轻肺上皮细胞中次氯酸诱导的8-oxo-dGuo形成与突变的研究

本文揭示了在肺中性粒细胞炎症（PNI）中，髓过氧化物酶（MPO）产生的次氯酸（HOCl）诱导DNA自由基形成的关键机制。研究证实，利用自旋捕获剂DMPO可有效阻断DNA自由基，进而抑制8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine（8-oxo-dGuo）的生成及hypoxanthine phosphoribosyl transferase（hrpt）基因突变，为炎症相关基因毒性和致癌过程提供了新的干预策略。

　　

1. 引言

肺中性粒细胞炎症（PNI）是由生物、物理、机械或代谢刺激物引发的炎症过程，涉及中性粒细胞在微血管系统中的募集和活化，并伴随髓过氧化物酶（MPO）在气道中的释放。MPO可被旁观者上皮细胞摄取，并在细胞内生成次氯酸（HOCl）。HOCl与DNA反应产生DNA自由基，这些自由基进一步衰变形成多种诱变终氧化产物，例如8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxyguanosine（8-oxo-dGuo）。本研究旨在验证HOCl诱导的DNA自由基是否先于DNA氧化和诱变过程，并探索自旋捕获剂5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide（DMPO）通过捕获DNA自由基以阻断8-oxo-dGuo生成及基因突变的潜力。

2. 方法

2.1. 纯化人MPO的处理

使用高纯度人MPO，部分经KCN或3-amino-1,2,4-triazole（ATZ）预处理以失活酶活，通过光谱法测定酶活性和纯度。

2.2. DNA自由基生成的生化系统

在含Cl^?的磷酸缓冲液中，将MPO与calf thymus DNA共孵育，加入H₂O₂启动HOCl生成，随后加入DMPO捕获DNA自由基，形成DNA-DMPO硝酮加合物。

2.3. A549细胞培养与MPO加载

人肺上皮细胞A549与MPO共孵育以实现细胞内MPO负载，随后用H₂O₂或葡萄糖/葡萄糖氧化酶（Glu/GO）系统刺激HOCl生成。

2.4. 中性粒细胞分离及与A549细胞共培养

从人血中分离中性粒细胞，与A549细胞共培养并以PMA激活，诱导中性粒细胞外诱捕网（NETs）形成。

2.5. 共聚焦显微镜

通过免疫荧光染色观察MPO、p53和组蛋白H2B的亚细胞定位，使用DAPI进行核染色。

2.6. H₂O₂触发HOCl生成的测定

利用luminol或APF荧光探针检测细胞内HOCl水平。

2.7. 双链DNA定量

使用DAPI荧光法测定细胞或平板中DNA含量。

2.8. 细胞活力与GAPDH活性测定

通过MTT还原实验、中性红摄取及LDH释放评估细胞毒性；GAPDH活性用于反映早期氧化损伤。

2.9. 细胞分馏与Western blot

分离胞浆与核蛋白组分，检测p53核转位情况。

2.10. DNA提取与8-oxo-dGuo及DNA-DMPO加合物测定

提取基因组DNA后，通过ELISA定量8-oxo-dGuo和DNA-DMPO加合物。

2.11. 6-硫鸟嘌呤（6-TG）诱变实验

用6-TG筛选hrpt基因突变细胞，通过存活细胞数评估突变频率。

2.12. 统计学分析

使用GraphPad Prism进行t检验或ANOVA分析，以p < 0.05为显著性阈值。

3. 结果

3.1. MPO活性诱导的HOCl引起DNA自由基形成

在含MPO和H₂O₂的体外系统中，HOCl导致DNA自由基生成，该过程可被DMPO捕获，形成稳定的DNA-DMPO加合物。MPO抑制剂（KCN、ABAH、SHA）及HOCl清除剂（牛磺酸、甲硫氨酸）显著降低加合物形成。

3.2. 细胞内MPO生成HOCl并导致DNA自由基

共聚焦显微镜显示，在PMA激活的中性粒细胞与A549细胞共培养体系中，MPO定位于核周区域。A549细胞内MPO加载后，HOCl的生成引起GAPDH活性下降及细胞毒性，这些效应可被DMPO和HOCl清除剂所抑制。

3.3. DMPO捕获DNA自由基阻止8-oxo-dGuo形成

在Glu/GO系统持续产生H₂O₂的条件下，MPO加载细胞中检出高水平8-oxo-dGuo；而DMPO存在时，DNA-DMPO加合物增加，8-oxo-dGuo生成受抑。使用失活MPO则无此效应。

3.4. DMPO阻止hrpt基因突变

HOCl生成导致p53蛋白核转位，提示DNA损伤应答激活。6-TG抗性实验显示，MPO/H₂O₂处理显著增加突变细胞数，而DMPO预处理则显著降低突变频率。

4. 讨论

本研究系统证明了在PNI背景下，MPO衍生的HOCl诱导线粒体DNA自由基生成，进而导致氧化损伤产物（如8-oxo-dGuo）积累和基因突变。DMPO作为自由基捕获剂，有效中断上述过程，抑制p53活化及hrpt突变。该发现为炎症相关肺致癌机制提供了新型分子见解，并提示靶向DNA自由基可能成为预防PNI相关基因毒性的治疗策略。