通过单细胞安培法进行单融合孔分析，发现孔扩张功能受损，这限制了2型糖尿病患者体内的胰岛素外泌过程

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：Single Fusion Pore Analysis via Single Cell Amperometry Uncovers Impaired Pore Expansion That Restricts Insulin Exocytosis in Human Type 2 Diabetes

胰岛素分泌缺陷与融合孔道动力学异常及定位蛋白减少相关。采用单细胞电化学分析（SCA）和TIRF显微镜技术，发现2型糖尿病（T2D）患者β细胞中融合孔道开放过早终止（缩短开放时间）、 docked vesicles数量减少，导致胰岛素释放效率降低。该研究首次揭示T2D通过影响融合孔道动态和 vesicle docking 表现为分子 sieve缺陷，为靶向治疗提供新思路。

　　胰岛β细胞通过一种快速的机制释放胰岛素，这种机制被称为胞吐作用，其核心步骤是形成融合孔（fusion pore）。融合孔是连接囊泡内部与细胞外空间的通道，决定了胰岛素释放的效率和速率。这项研究通过先进的单细胞电化学技术（如实时单细胞伏安法，SCA）和光学技术（如全内反射荧光显微镜，TIRF）相结合，对健康人和2型糖尿病（T2D）患者来源的β细胞中的融合孔动态进行了系统性分析。研究发现，T2D患者的β细胞在融合孔形成过程中表现出显著的异常，这可能成为胰岛素分泌减少的重要原因，从而为糖尿病的治疗提供了新的视角和潜在靶点。

胰岛素的分泌是维持血糖稳态的重要生理过程。在正常情况下，当血糖水平升高时，胰岛β细胞会通过一系列复杂的信号传导途径，包括膜去极化、动作电位的产生以及细胞内钙离子浓度的增加，最终触发胰岛素囊泡的胞吐作用。胰岛素储存在一种称为大致密核心囊泡（LDCVs）的细胞器中，其直径约为300纳米。这些囊泡中的胰岛素通常与锌离子形成稳定的晶体结构，这种结构在胞吐过程中会因细胞外环境的碱化而被破坏，从而释放胰岛素。然而，这一过程在糖尿病患者的β细胞中可能受到干扰，导致胰岛素分泌效率降低。

为了更精确地研究这一过程，研究团队采用了一种高灵敏度的单细胞电化学技术。这种技术利用微型电极测量电活性分子的释放，如血清素（5-HT），作为胰岛素释放的替代指标。血清素通过囊泡单胺转运蛋白（VMAT-2）在β细胞中积累，并在胞吐过程中与胰岛素一同释放。相比胰岛素，血清素更容易被碳纤维微电极（CFME）氧化，因此能够提供更清晰的电化学信号。然而，血清素在囊泡中的含量较低，因此研究者通过预先加载血清素的方法，以确保其在胞吐过程中可以被有效检测。

研究结果显示，在T2D患者的β细胞中，血清素的释放量显著低于健康对照组。健康β细胞中，每次胞吐事件释放的血清素分子数量平均为858,000 ± 82,000个，而T2D患者的β细胞仅为473,000 ± 76,000个。这一发现表明，T2D患者的β细胞在胰岛素释放过程中存在某种缺陷，可能与融合孔的形成和维持有关。此外，研究还发现，T2D患者的β细胞在胞吐事件的频率上并没有显著减少，说明问题可能并不在于囊泡数量的减少，而是在于每个囊泡释放效率的降低。

融合孔的形成和关闭是胞吐过程中的关键环节。研究者通过分析电化学信号的上升时间、半高宽和下降时间，来评估融合孔的动态变化。结果显示，T2D患者的β细胞中，融合孔的开启时间缩短，关闭时间加快，这意味着融合孔的开放时间更短，从而减少了胰岛素释放的窗口。尽管上升时间在T2D组中有所增加，但这一变化并未达到统计学显著性，表明融合孔的开启过程可能并未受到显著影响，而关闭过程则明显受到干扰。这种融合孔的异常动态可能影响了胰岛素的释放量，因为融合孔的开放时间越短，胰岛素分子就有更少的时间通过该通道被释放到细胞外空间。

进一步的研究表明，T2D患者的β细胞中，融合孔的形成可能受到SNARE蛋白（如syntaxin和synaptotagmin）的调控异常影响。SNARE蛋白在融合孔的形成和关闭过程中起着关键作用，它们通过结构上的相互作用，类似于“拉链”机制，促进囊泡与细胞膜的融合。在T2D患者的β细胞中，这种机制可能受到干扰，导致融合孔的形成和关闭时间发生变化。这种变化可能与胰岛素分子的体积较大有关，因为胰岛素在六聚体形式下的尺寸远大于血清素，使得其通过融合孔的难度更大。因此，即使融合孔的动态变化较小，胰岛素的释放量也可能受到显著影响。

除了融合孔的动态变化，研究还发现T2D患者的β细胞中，与胞吐相关的囊泡锚定（docking）数量也有所减少。囊泡必须与细胞膜紧密接触才能被激活，从而触发胞吐过程。研究者使用TIRF显微镜观察了β细胞中锚定囊泡的密度，并发现T2D患者的β细胞中锚定囊泡的数量显著低于健康对照组。这一结果表明，T2D不仅影响了融合孔的动态，还可能干扰了囊泡与细胞膜的接触过程，从而降低了胰岛素释放的整体效率。

值得注意的是，研究团队在分析过程中排除了性别对胰岛素分泌的影响。尽管T2D在男性中的发病率略高于女性，但实验结果显示，无论是男性还是女性来源的β细胞，其在高钾刺激下的胰岛素分泌量差异并不显著。因此，性别并不是导致T2D患者胰岛素分泌减少的主要因素，而可能是其他更深层次的细胞机制在起作用。

研究的结论指出，T2D可能是一种“融合孔障碍”，即其核心病理特征之一是融合孔的动态异常。尽管之前的研究已经揭示了T2D的多基因特征，但本研究首次从融合孔的角度解释了胰岛素分泌减少的机制。这种异常可能与糖尿病环境中的高血糖、游离脂肪酸等代谢因素有关，这些因素可能干扰了融合孔的正常功能，从而影响了胰岛素的释放效率。

此外，研究团队还探讨了融合孔异常的潜在治疗意义。由于融合孔的动态变化是胰岛素释放的关键环节，因此针对这一过程的干预可能有助于改善胰岛素分泌功能。例如，通过调节SNARE蛋白的表达或活性，或者开发能够促进融合孔开放的药物，可能为T2D的治疗提供新的思路。然而，目前尚不清楚这些异常是否可以通过现有的药物进行有效调控，因此需要进一步的研究来探索可能的治疗靶点。

总的来说，这项研究为理解T2D的发病机制提供了新的视角。通过结合高分辨率的电化学和光学技术，研究者首次揭示了T2D患者的β细胞在融合孔形成和维持过程中的异常，这种异常可能独立于其遗传背景，而是由环境因素或代谢紊乱引起的。这些发现不仅加深了我们对胰岛素分泌机制的理解，还为未来开发新的治疗策略提供了理论依据。未来的研究可以进一步探讨这些异常的具体分子机制，并评估潜在的干预措施是否能够有效恢复融合孔的正常功能，从而改善胰岛素分泌，缓解T2D的病理过程。