红外多光子解离质谱鉴定D-果糖脱水产物：捕捉难以捉摸的5-羟甲基糠醛异构体的光谱指纹

本刊推荐：本研究通过结合电喷雾红外多光子解离质谱（ESI-IRMPD-MS）与密度泛函理论（DFT）计算，首次在气相中揭示了D-果糖三重脱水产物的精细结构特征。研究发现了两种离子种群（羰基质子化结构和C2质子化结构）的共存现象，并通过精确的光谱指认破解了长期存在的5-HMF异构体鉴定难题，为碳水化合物气相反应机理和生物质转化研究提供了分子水平的深刻见解。

　　

摘要

一项结合电喷雾红外多光子解离质谱（ESI-IRMPD-MS）和密度泛函理论（DFT）的研究成功阐明了D-果糖在气相中发生三重脱水反应所产生物种的结构特征。实验方案通过测量并比较不同离子群体的IRMPD光谱来实现：包括质子化的5-羟甲基糠醛（[HMF·H]⁺）以及来自铵-D-果糖复合物（[Fru·NH₄]⁺）三重脱水产生的离子物种。对[Fru·NH₄]⁺进行红外光子诱导解离，揭示了两个离子群体的共存现象，它们源于离子前体的两条独立且不相交的碎裂路径。一个群体的IRMPD光谱与（[HMF·H]⁺）相匹配，对应于羰基质子化结构。第二个离子产物则是其C2质子化的质子异构体，其能量比全局最小值高75 kJ/mol。这种不太稳定的质子异构体的存在很可能是由于其气相动力学陷阱所致。这些发现有助于在分子水平上更精细地理解气相碳水化合物的脱水反应和异构体形成。

图示摘要精要地指出：在铵-D-果糖的三重脱水过程中，共存着两种不同的离子群体，它们源于独立且不相交的碎裂路径：i）低能量群体，为羰基质子化结构；ii）高能量群体，为C2质子化结构，尽管热力学不稳定，但因动力学陷阱而得以存在。

1 引言

5-羟甲基糠醛（5-HMF， Scheme 1）是一个具有重要意义、相对刚性的小有机分子，涉及食品、制药和生物燃料等多个持续争论的领域。5-HMF可被视为一种食品质量标志物，特别是在蜂蜜、果汁、牛奶和咖啡基质中。它对人类健康具有高度毒性，因其能在胃肠道迅速吸收，并代谢转化为对粘膜具有刺激甚至诱变效应的不同衍生物。众所周知，5-HMF是在食品热加工过程中通过美拉德反应或酸催化糖降解形成的，其产率取决于温度和介质酸度。5-HMF在药物化学中极具相关性，因其作为中间体，可以以良好产率和可持续的方式生产有价值的化学品。可持续性是利用大量关注5-HMF化学的出版物所传递信息的关键词。从非化石来源生产含碳化合物多年来一直是研究人员的重要焦点，他们致力于发现和设计能够利用可再生资源并将其扩大到工业规模的新技术。事实上，纤维素是一种完全可再生的原料，可以初步水解为纤维二糖，最终水解为葡萄糖，葡萄糖进而异构化为果糖，而果糖是5-HMF的最佳前体。糖降解为5-HMF的机理在凝聚相中已被广泛探索，但在过去十年中，它也刺激了通过质谱（MS）方法进行的气相研究，这些研究专注于在分子水平上研究裸体系。MS研究提供了几个重要优势，既能获取裸物种的固有性质，又能将实验结果与真空计算进行比较，计算可以提供关于分子系统结构特征的非常详细的信息。Pepi等人进行的MS研究指出，D-果糖的酸催化气相脱水产生了一个物种，它可能是质子化的5-HMF（本文表示为[HMF·H]⁺）的质子异构体或结构异构体。在随后的论文中，Troiani等人观察到在铵催化的D-果糖脱水过程中存在两条碎裂路径，产生两个同量异位离子产物，即[HMF·H]⁺及其异构衍生物，本文表示为[126·H]⁺。由于MS结构分辨能力的限制，[126·H]⁺离子的化学身份仍然是一个难以通过实验获得的信息。本研究提出采用电喷雾红外多光子解离质谱（ESI-IRMPD-MS）方法来阐明这一具有挑战性的鉴定难题，利用一种能够阐明非常精细的分子内或分子间特征的灵敏技术。将来自5-HMF标准溶液的[HMF·H]⁺离子的IRMPD光谱与分离自铵催化D-果糖脱水产生的[126·H]⁺离子的光谱进行比较。实验光谱最终通过B3LYP-D3/6-311++G**理论水平的理论计算进行了验证。

2 结果与讨论

2.1 材料与方法

2.1.1 IRMPD实验

5-HMF购自商业来源，溶于甲醇至10^?4 M终浓度，无需进一步纯化。ESI产生的离子云被引入改装后的Bruker Esquire 6000四极离子阱中，并使用标准Bruker Esquire Control (v6.2) 软件进行分离。使用的ESI条件如下：注射泵流速：100 μL h^?1；喷雾电压：3500 V；毛细管温度：250 °C。在MS²步骤中，将质量选择后的离子云进行辐照，并将激发振幅设为零以避免任何碰撞诱导解离（CID）过程。质谱在标准质量范围（m/z 50–3000 u）和正常扫描模式分辨率（13000 u s^?1）下记录，累积时间固定为0.5秒。使用LaserVision的红外（IR）OPO/OPA系统（由10 Hz Nd:YAG激光器Excel Technology Europe GmbH Surelite-II泵浦，650 mJ/脉冲，8 ns脉冲持续时间）探索2800–3700 cm^?1的波数范围。在3400至3600 cm^?1之间测量的输出能量约为20 mJ/脉冲，光谱带宽约为≈5 cm^?1。光子能量以0.1 cm^?1 s^?1的速率增加。在第二个实验中，将商业D-果糖溶于甲醇至10^?4 M终浓度，并加入0.1% CH₃CO₂NH₄。分离[Fru·NH₄]⁺ (m/z 198)并通过碰撞活化诱导其解离为最终的[126·H]⁺离子，该离子随后进行多光子解离。碎裂效率报告为任意单位R，定义为 R = ?log[(I_prec)/(I_prec+I_frag)]，其中I_prec是前体离子的强度，I_frag是其碎片离子的强度。

2.2 计算细节

所有计算均使用Gaussian16软件在密度泛函理论框架下进行，使用B3LYP混合泛函并结合经验色散校正（B3LYP-D3）和6-311++G**基组。所有物种首先进行优化，然后通过计算谐波频率表征为真实极小值。相同的频率随后用于模拟正文中报道的光谱。为此，所有感兴趣的峰均用高斯函数拟合，其sigma值经过调整以再现实验峰宽。需要注意的是，基于相应跃迁偶极矩评估的光谱强度不一定与实验强度一致。因此，模拟的光谱应仅在其吸收频率方面提供信息。基于实验光谱与计算光谱之间的匹配，使用了0.953的值来缩放计算频率。特别是，拟合基于实验波段在3662 cm^?1处的对应关系，该波段只能是一个未受干扰的CH₂O-H的伸缩振动，以及四个最稳定计算结构的最蓝移计算频率。

2.3 结果

2.3.1 电喷雾红外多光子解离质谱（ESI-IRMPD）光谱

5-HMF溶液的ESI全谱主要由质子化的[HMF·H]⁺离子（m/z 127）主导，其次是丰度较低的[HMF·Na]⁺钠加合物种。[HMF·H]⁺离子在通过与缓冲气体碰撞（CID）或通过红外吸收在多光子事件（IRMPD）中进行活化后，产生脱水衍生物（m/z 109）作为唯一产物离子。不同的是，对含有D-果糖和0.1% CH₃CO₂NH₄的甲醇溶液进行电喷雾得到的全谱显示了[Fru·NH₄]⁺ (m/z 198)铵络合物的强峰，但未检测到显著量的相关[Fru·H]⁺质子化离子（m/z 181），后者是一种不稳定的离子物种，会迅速发生第一次脱水。遗憾的是，我们无法重现参考文献中描述的实验流程，因为经由不同MSⁿ途径分离出的三重脱水果糖离子（m/z 127）强度太低，无法获取其IRMPD光谱。因此，我们直接将[Fru·NH₄]⁺离子（m/z 198）的MS²产物[126·H]⁺离子进行分离，该离子经历了伴随氨丢失的三重脱水。除了脱水产物（m/z 109），对源自[Fru·NH₄]⁺诱导碎裂的[126·H]⁺离子进行的CID和IRMPD实验均产生了几个产物离子（m/z 99, 69, 和 55）。同量异位的[HMF·H]⁺和[126·H]⁺离子不同的解离模式表明至少存在两种不同的离子群体，包括5-HMF的异构体或质子异构体，其结构可以通过IRMPD测量进行实验探测。[HMF·H]⁺的IRMPD光谱（图 1a）的特征是在3490–3680 cm^?1范围内有三个波段（即3518, 3585, 和3662 cm^?1）。另一方面，源自铵-D-果糖碎裂的[126·H]⁺ IRMPD光谱（图 1b）可清楚地归因于至少两个不同离子群体的存在：产生m/z 109离子的脱水群体（图 1b中的黑线），以及产生m/z 55, 69, 和 99的产物离子（图 1b）。除了以极低浓度形成的m/z 69离子外，99和55离子的相对强度在整个研究的光谱范围内基本恒定（图 2）。这一证据可靠地表明，至少有两个质子化物种（可能是异构体或质子异构体）被分离并进行光谱活化：一个负责产生m/z = 109产物离子，同时第二个产生m/z 55, 69, 和 99离子三元组。此外，图 1b中的黑色轮廓与[HMF·H⁺]光谱（图 1a）完美重叠，明确表明在D-果糖三重脱水后形成了相同的[HMF·H⁺]离子群体。最后，所有观察到的解离通道共有的最蓝移吸收（3662 cm^?1）（图 1a,b）很可能归因于未配位醇基团的伸缩模式，因此不能作为实际离子结构的诊断依据。

2.3.2 计算结构

IRMPD光谱的解释得到了在B3LYP-D3/6-311++G**理论水平上进行的构象分析的支持。研究了两类质子异构体，即羰基质子化结构和环质子化结构（分别为图 3–10 中的 CO1–9 和 R1–11），其相关能量见表 1。关于 COn 群体（n = 1–9），通过旋转 O1’-C1’-C2-C3 (α) 和 H⁺-O1’-C1’-C2 (β) 二面角来探索质子化羰基的自由度，这些角度被设定为 0° 和 180° 值（图 3-5–6）。此外，描述 –CH₂OH 部分相对于环的位置的 O5’-C5’-C5-O1 (γ) 二面角，通过不同的输入结构允许探索多个值（图 3–6）。在最稳定的结构（CO1）中，α–β–γ 三元组对应 180°–0°–180° 值，指向一个平面物种，可能涉及一个弱的质子-O1 相互作用的分子内折叠（2.41 ?）。然而，DFT能量受 H⁺-O1’-C1-C2 角 180° 旋转的影响不显著（CO1 → CO3），表明分子内氢键相互作用非常弱。移除 O5’···H4 相互作用，同时伴随 O1/O5’ 孤对电子朝向，使离子稳定性降低数个 kJ/mol（CO1 → CO2, CO3 → CO4, CO7 → CO6, 和 CO8 → CO9 转换）；类似地，CO3 → CO5 转换，有利于 O5’/环 π 系统静电排斥，使计算结构失稳 16.2 kJ mol^?1。最后，伴随 CO7 → CO8 转换的 11.7 kJ mol^?1 失稳很可能是由于 H⁺···H3 强排斥相互作用所致。关于环质子化群体（图 7-9–10），最稳定的结构（R1）是一个 C2 质子化物种，比 CO1 高 63.8 kJ mol^?1。接下来的 C-质子化结构比 R1 质子异构体稳定性低不少于 27.8 kJ mol^?1。

3 讨论

3.1 [HMF·H]⁺ 离子的 IRMPD

由于羰基氧的碱性显著更高，将[HMF·H]⁺离子的IRMPD光谱与图 3–6 中根据每个物种特定构象特征分组的所有羰基质子化结构的计算光谱进行了比较。

CO1–9 结构的光谱基本上由两个峰主导，它们是 O1’–H⁺ 和 O5’–H 伸缩振动模式的光谱特征，后者总是发生蓝移。低于 3200 cm^?1 的峰强度肯定较低，源于 C–H 伸缩振动，在实验中未检测到。对图 3–6 的检查支持了以下假设：实验波段 3515 cm^?1 可归因于 CO2 构象体的 O1’–H⁺ 伸缩频率（3524 cm^?1）。有趣的是，最稳定的构象体 CO1（比 CO2 低 10.5 kJ mol^?1）似乎没有光谱布居。3515 cm^?1 波段的特征（低、宽且嘈杂）与部分 IRMPD “透明性”的发生非常吻合，这是由于质子与 O1 孤对电子之间建立了弱分子内相互作用。在其他羰基质子化结构（CO3–9 图 4–6）的计算光谱中，其中质子-O1 相互作用被移除，O1’–H⁺ 伸缩显著蓝移到一个光谱区域，该区域在实验上由以 3584 cm^?1 为中心的大波段主导。事实上，后一个吸收可以很容易地归属于包含在 CO3–5 簇中的构象体（图 4）的 O1’–H⁺ 伸缩，其主要结构特征是 α = 180° 和 β = 180° 的值对。CO3 和 CO4 构象体中计算的 O5’–H 伸缩（3663 和 3654 cm^?1）与实验中最蓝的波段（3660 cm^?1）的极好重叠强烈表明，来自这些结构的 [HMF·H]⁺ 离子对气相群体有重要贡献，特别是来自更稳定的 CO3，它占据了一个非常接近全局最小值（+0.6 kJ mol^?1）的位置。最后，基于光谱和能量的综合考虑，布居所选离子云的羰基质子化物种是 CO2 和 CO3，它们提供了非常特异性的红外特征（图 3,4）。

3.2 [126·H]⁺ 离子的 IRMPD

[126·H]⁺ 离子的 IRMPD 光谱，作为 m/z 99, 69, 和 55 离子轮廓的贡献结果（图 2），与图 7–10 中环质子化结构的计算光谱进行了比较，其中质子异构体根据质子化位点进行了分组。所有计算光谱的 3200–3700 cm^?1 区域都由一个对应于 O5’–H 伸缩的波段主导。

图 7–10 中报告的比较指出，位于 3620 和 3645 cm^?1 之间的嘈杂实验波段与 R2 (3638 cm^?1) 和 R3 (3644 cm^?1) C2-质子化结构以及 R9 (3622 cm^?1) C4-质子化质子异构体的吸收非常吻合。一方面，我们可以排除 R9 结构的存在，因为其能量含量显著（比最稳定的环质子化物种高 47.6 kJ mol^?1），但值得注意的是，最稳定的环质子化结构 R1（比 R2 能量低 11.3 kJ mol^?1）似乎没有光谱相关性，因为其吸收蓝移至 3658 cm^?1。

总结光谱证据，从甲醇 5-HMF 溶液中分离出的 [HMF·H]⁺ 离子作为两种羰基质子化结构的混合物存在，对应于 CO2 和 CO3 构象体。这些结构代表两个构象家族， differing in the β dihedral angle value. 如果考虑到 CO3 和 CO4 物种之间的强烈光谱相似性，则不能排除 CO4 结构存在于气相群体中。另一方面，正如 Troiani 等人所确立的，果糖的三重脱水可以由铵离子仅在第一步辅助（方案 2 中的路径 3）或在整个过程中辅助（方案 2 中的路径 1）。这种分支发生在 [162·H·NH₃]⁺ 离子水平，决定了两个最终质子异构体群体的形成，它们表现出不同的 MS2 碎裂模式。我们的 ESI-IRMPD 工作流程收集了 1/3 路径下游的两种离子群体，并根据不同的光谱特征对它们进行了区分，即羰基质子化的 CO2/CO3 构象体（方案 2 路径 1 的最终产物）和 C2-质子化的 R2/R3 物种（方案 2 路径 3 的最终产物）。值得注意的是，在这两个质子异构体群体中，我们都没有观察到最稳定结构的光谱特征，即 CO1 和 R1 质子异构体，它们分别比检测到的构象体能量低 10.5 和 11.3 kJ mol^?1。测量的 IRMPD 光谱中缺少 CO1 构象体可能归因于优先形成了其他稍微不太稳定的异构体，这些异构体在释放到气相后无法转化为更稳定的气相对应物。这些物种的形成可能是在 5-HMF 溶液电喷雾过程中由溶剂辅助的动力学陷阱和/或在 [Fru·NH₄]⁺ 离子气相脱水过程中由 NH₃ 辅助的动力学陷阱所致。此外，R2/R3 环质子化物种源于气相中铵离子辅助的果糖三重脱水途径，该途径沿着不同的反应坐标进行，产生一个不转化为最稳定 R1 构象体的最终离子群体。在这两种情况下，围绕 γ 角的旋转触发了 CO1 ? CO2 和 R1 ? R2 转换，很可能涉及 20–25 kJ mol^?1 的扭转势垒，在我们的实验条件下不能被认为是完全自由的旋转。一个进一步难以实验验证的假设可能是在振动激发期间偶极矩变化的显著差异，这使得即使不是较低能量的物种，也能 enable 特定旋转异构体的吸收。

4 结论

通过 ESI-IRMPD-MS 测量探测了铵-D-果糖三重脱水的产物。首先，质子化 5-HMF 的 IRMPD 光谱测量表明了两个羰基质子化构象体的共存，两者均以 α = 180° 为特征，但 differing by the value of the β angle，在 CO2 和 CO3 中分别为 0° 或 180°。从铵-D-果糖加合物的三重脱水路径下游分离出的离子物种由两个异构离子群体组成：质子化的 5-HMF（CO2 和 CO3 旋转异构体）和一个 C2-环质子化的群体（R2 和 R3 物种），其能量与羰基质子化结构相比非常高（比全局最小值高 +75.1 kJ mol^?1）。具有非常高能量含量的结构的形成很可能是由于其沿着一个反应坐标的动力学陷阱，该坐标不允许离子群体通过跨越一个明确的高活化势垒（约 125.5 kJ mol^?1）而演化成更稳定的物种。两种质子异构体群体的共存与两条不同的碎裂路径的存在相一致，这两条路径 differing in the sequence of neutral loss and then in the specific role of the ammonium cation。