结合春化与黄化预处理优化培养条件建立凤丹高效组织培养体系

本研究针对油用牡丹凤丹(Paeonia ostii)传统繁殖效率低、周期长的问题，通过整合春化(vernalization)与黄化(etiolation)预处理技术，优化单节段和叶片外植体的灭菌程序、培养基配方(NN69培养基)、植物生长调节剂组合(IBA与CPPU)及光质调控(混合白光-红光)，成功建立了高效离体再生平台，显著提高了器官发生响应、减少了褐化现象，为凤丹大规模克隆繁殖和遗传改良提供了关键技术支撑。

　　

牡丹作为“花中之王”不仅具有极高的观赏价值，更在大健康产业中展现出独特潜力。其中凤丹(Paeonia ostii)因其种子富含高营养价值的不饱和脂肪酸（α-亚麻酸含量高达26.7%-50%），被誉为“东方橄榄油”，在功能性食品、保健品和化妆品领域具有广阔应用前景。然而，这一重要油料作物的产业化发展却面临严峻挑战——传统分株或嫁接繁殖每年仅能获得5-10株新植株，繁殖效率极低；而种子繁殖虽然数量较多，但后代遗传变异会导致商业性状不一致，无法满足标准化生产需求。更令人困扰的是，木本牡丹的组织培养一直存在外植体褐化严重、芽增殖有限、玻璃化现象和生根困难等技术瓶颈，其中多酚氧化酶(PPO)介导的内源酚类物质氧化导致的酶促褐化是最关键的障碍，不仅引起外植体坏死，还通过醌类化合物诱导的细胞毒性和生长素降解破坏器官发生潜力。这些长期存在的技术难题严重制约了凤丹的规模化无性繁殖和遗传改良进程。

为了突破这些技术壁垒，南京林业大学的研究团队在《Plant Methods》上发表了创新性研究成果，通过将春化和黄化两种生理预处理方法与优化培养条件相结合，成功建立了凤丹高效组织培养体系。研究人员以10年生“凤丹3号”无性系分株苗为材料，对其施加50天5℃黑暗春化处理加20天25℃黑暗黄化处理的组合预处理，系统优化了单节段和叶片外植体的消毒程序、基础培养基筛选、植物生长调节剂配比和光质调控条件。

研究采用的关键技术方法包括：春化与黄化组合预处理技术、单节段与叶片外植体灭菌程序优化、NN69/MS/WPM三种基础培养基筛选、不同浓度IBA和CPPU植物生长调节剂组合实验、白光-红光混合光质调控处理、扫描电子显微镜(SEM)超微结构观察等。所有实验均设置三个独立生物学重复，每个处理包含30个外植体，数据采用SPSS进行方差分析和Duncan多重比较。

优化外植体消毒条件

研究发现了灭菌效果与组织损伤之间的显著平衡关系。对于单节段外植体，0.1% HgCl₂处理5.5分钟能在污染控制(8.9%)和褐化抑制(14.4%)间达到最佳平衡；而叶片外植体以4.5分钟处理效果最优(污染率7.8%，褐化率23.3%)。比较四种预处理组合发现，完全春化+黄化(V+E)处理 consistently表现最佳，而非处理组(NV+NE)表现最差，单节段外植体污染率和褐化率分别高达30.0%和35.6%。

单节段外植体组织培养

在腋芽来源芽诱导阶段，NN69培养基表现出最高芽诱导率(66.7%)，显著优于WPM(57.8%)和MS(22.2%)培养基。芽增殖实验中，0.1 mg·L^-1 IBA(吲哚-3-丁酸)与0.2 mg·L^-1 CPPU(N-(2-氯-4-吡啶基)-N'-苯基脲)组合在实现高增殖系数(4.5倍)的同时完全避免了玻璃化现象。芽伸长研究揭示了光照质量比激素处理更具优势：混合白光-红光(W:R=7:1)处理获得最长芽体(2.27 cm)且无生理紊乱，而GA₃(赤霉素)处理虽能促进伸长但会引发褐化和玻璃化。

叶片组织培养与再生

在愈伤组织诱导阶段，0.3 mg·L^-1 IBA与0.9 mg·L^-1 CPPU组合获得最高诱导率(67.8%)，产生丰满、嫩绿色且无褐化的愈伤组织。扫描电镜超微结构分析揭示了愈伤组织发育的时空动态模式：培养10天时组织紧密、表面粗糙；15天出现细胞扩张和表面平滑化；20天形成稳定的器官发生平台。芽器官发生阶段，0.2 mg·L^-1 IBA与0.2 mg·L^-1 CPPU组合实现最高芽诱导率(54.4%)且完全抑制了褐化。

再生芽生根表现

在生根培养基中添加0.2 mg·L^-1 IBA和3 mg·L^-1 CaCl₂显著改善了所有生根参数，生根率提高至60.0%，平均根数达2.7条，根长增至4.0 cm，且根起始时间缩短至45天。钙离子不仅作为必需矿质营养促进根生长，还作为第二信使介导生长素信号转导，同时有效抑制PPO活性从而减缓酚类氧化。

研究结论表明，春化和黄化处理通过互补机制协同增强外植体再生能力：春化主要通过上调内源激素(如赤霉素)和抗氧化酶(POD、SOD)活性激活代谢途径，使植物进入更活跃的生长状态；而黄化则通过抑制光形态建成——抑制叶绿素生物合成和酚类积累——降低光合活性和氧化应激，从而减轻外植体褐化。两种预处理的组合使用表现出协同效应，在获得最高诱导率的同时实现了最小褐化。

这项研究建立的综合离体繁殖系统通过将春化与黄化预处理与优化灭菌方案、培养基配方和光质控制相结合，成功解决了牡丹组织培养中的两大生理限制因素——褐化和玻璃化问题。该技术体系使用营养器官外植体而非种子来源材料，建立了更可靠、可扩展的微繁殖平台，在保持遗传稳定性的同时保护了品种特异性状，为凤丹的大规模商业化开发和植物医药应用提供了关键技术支撑，对推动油用牡丹产业的可持续发展具有重要意义。