氮肥对不同产量类型水稻氮素利用效率及氮代谢特性的响应研究

本刊推荐：本研究通过两年田间试验，系统揭示了不同产量类型水稻品种（HYV/LYV）对氮肥梯度（225-315 kg·ha?1）的响应机制。发现高产品种具有更高的氮积累量（NA）、氮干物质生产效率（NDMPE）和稳定的氮代谢酶（NR/GOGAT/Fd-GOGAT）活性，明确了籽粒灌浆期可溶性蛋白含量与氮转运效率的正相关性，为水稻高产氮高效（NUE）品种选育提供了关键生理指标和理论依据。

　　

1 引言

中国作物产量增长长期依赖过量氮肥施用，但其产投比已显著超越全球平均水平，导致土壤酸化、温室气体排放和水体富营养化等环境问题。实现从单纯追求产量向兼顾品质、效率、生态安全和食品安全的转型，需通过降低肥料投入和提高氮素利用效率（NUE）来实现。水稻NUE具有品种、肥料和管理特异性，早期研究将谷物产量与氮干物质生产效率相关联，并表明减少施肥频次可改善农艺、生理和回收效率。抽穗期氮积累为后续向穗部再动员提供了源基础，而灌浆期持续氮供应支撑最终产量。因此，整个灌浆期的氮吸收和再动员是同时提高水稻产量和NUE的关键杠杆。

水稻氮代谢描述了从根系到籽粒的氮同化利用全过程，其强度由可溶性蛋白浓度指示——这是植株内主要的瞬时氮库。土壤中的NO₃^?被根系吸收后，由硝酸还原酶（NR）还原为NO₂^?，随后通过GS/GOGAT循环并入氨基酸。在该循环中，谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是催化水稻氨同化的核心酶。NR和GOGAT的活性受外部氮浓度和发育阶段调控，通过底物感知反馈调节自身及其他氮代谢基因的表达，从而控制全株氮获取和利用。较高的氮供应上调NR活性，加速灌浆期弱势粒的充实速率，并间接增强蔗糖-淀粉转化过程。GOGAT活性升高可加速氮从成熟组织向新生组织的再动员，是水稻氮利用效率（NUE）和谷物产量的主要决定因素。在灌浆后期，功能叶中蛋白质水解释放的氨基酸被输出到籽粒用于储存蛋白合成；铁氧还蛋白依赖型谷氨酸合成酶（Fd-GOGAT）对于这种再动员和协调叶片衰老不可或缺。稳健的花后CO₂同化，加上高效的氮吸收-转运性状和强大的碳氮代谢能力，是高产基因型的典型特征。NR和GOGAT（包括Fd-GOGAT）现被认为是作物碳氮耦合效率的关键指标。

本研究旨在进一步探索高产和氮高效水稻品种的氮利用特性及与产量和氮利用相关的酶活性。基于水稻品种的初步筛选，选择高产品种扬籼25013（HYV）和低产品种扬籼35004（LYV）作为试验材料。在不同氮肥水平下，比较了两种产量类型的产量及其构成、氮利用效率以及关键氮代谢酶对施氮量的响应差异，为进一步阐明水稻高产与高氮利用效率耦合的机制及未来高产基因型选育提供理论基础。

2 材料与方法

试验于2022年和2023年在江苏省扬州市沙头镇扬州大学创新试验基地（32°23.4′ N，119°25.2′ E）进行。该地区位于亚热带季风湿润气候与温带季风气候的过渡带，四季分明，气候温和，雨量充沛。土壤类型为酸性砂壤土，有机质21.15 g·kg^?1，全氮1.40 g·kg^?1，碱解氮91.57 mg·kg^?1，有效磷16.01 mg·kg^?1，速效钾78.24 mg·kg^?1。

试验材料为从初步筛选中选出的两个产量差异显著的水稻品种：高产品种（扬籼25013；HYV）和低产品种（扬籼35004；LYV）。亲本基因型均为甬优2640（籼粳杂交种）和淮稻5号（粳稻栽培种）；生育期均为157天。

试验采用裂区设计，以氮肥为主区因素，品种为副区因素，田间重复两次。每个肥料处理设两个独立田间小区，每个小区随机选取3株植株作为一个重复进行后续分析。采用毯状育苗法育苗，播种日期为5月25日，移栽日期为6月20日，采用人工模拟机械移栽。每穴栽4株，行距28 cm，穴距12 cm。田间施氮比例为基肥:分蘖肥:穗肥=3.5:3.5:3。分蘖肥在移栽后7天施用，穗肥在倒四叶期（穗分化期）施用。所有处理均施磷（P₂O₅）135 kg·hm^?1和钾（K₂O）270 kg·hm^?1（1:2）。磷肥全部作基肥施用，钾肥在耕前施用和穗肥施用时平均分配。本研究在全生育期设置了三个施氮梯度：225 kg·hm^?1（N1）、270 kg·hm^?1（N2）和315 kg·hm^?1（N3）（纯氮基准）。后续田间管理措施，包括水分管理、病虫害和杂草防治，均按照当地高产栽培方案实施。

在抽穗期和成熟期采集植株样品，烘干至恒重，研磨后采用凯氏定氮法测定各器官氮含量。氮转运量计算为营养器官在成熟期和抽穗期氮积累量的差值。

氮利用效率计算公式如下：

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  谷物氮利用效率（NUEg, kg/kg）= [最终谷物干重（kg·ha^?1）] / [收获时地上部植株氮含量（kg·ha^?1）]
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  氮干物质生产效率（NDMPE）= 成熟期总干物质积累量 / 成熟期总氮积累量
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  氮收获指数（NHI）= 成熟期穗部总氮积累量 / 成熟期植株总氮积累量
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  氮偏生产力（NPKI）= 谷物产量 / 施氮量
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  氮转运贡献率（CRNT）= 营养器官再动员总氮量 / 植株总氮积累量
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  氮转运效率（NTE）= 营养器官再动员总氮量 / 抽穗期营养器官总氮含量

2023年进行了生理参数测定。在水稻灌浆期，从倒二叶中部取样。去除叶脉后，样品在液氮中速冻，随后转移至-80°C冰箱保存待测。

可溶性蛋白浓度测定：称取约0.1 g样品，与1 mL蒸馏水混合，在冰浴中匀浆。匀浆液在4°C下12000 rpm离心10 min，收集上清液并置于冰上待测。向试管中加入100 μL上清液和100 μL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀，在620 nm处测定吸光度。空白对照加入100 μL蒸馏水和100 μL考马斯亮蓝G-250溶液。净吸光度（ΔA）计算为ΔA = A_测定 ? A_空白。

硝酸还原酶（NR）活性测定：向烧杯中加入适量诱导剂（KNO₃溶液）。冲洗新鲜标本，用滤纸吸干，然后浸入诱导剂工作液（刚好浸没即可）。诱导2 h后，取出样品并用滤纸吸干。称取约0.1 g组织，加入1 mL提取缓冲液，在冰浴中匀浆。在4°C下8000 rpm离心10 min，收集上清液并置于冰上待测。酶标仪预热至少30 min，波长设置为340 nm。向微孔板孔中加入10 μL上清液、75 μL KNO₃溶液、90 μL蒸馏水和25 μL NADH溶液（NADH粉末溶于2 mL 0.1 M PBS，pH 7.5配制）。充分混匀后，记录1 min时的吸光度A₁和6 min时的吸光度A₂。计算吸光度差ΔA = A₁ ? A₂。

谷氨酸合成酶（GOGAT）活性测定：称取约0.1 g组织，加入1 mL提取缓冲液（HEPES缓冲液，pH 7.5，含PVP和EDTA）。在冰浴中匀浆混合物。在4°C下8000 rpm离心10 min，收集上清液并置于冰上待测。酶标仪预热至少30 min，波长设置为340 nm。吸取20 μL上清液与180 μL反应试剂（含α-酮戊二酸、谷氨酰胺和NADH，溶于9 mL HEPES缓冲液，pH 7.5）混合。混合后立即记录20 s（A₁）和5 min 20 s（A₂）时340 nm处的吸光度。计算吸光度差ΔA = A₁ ? A₂。

铁氧还蛋白依赖型谷氨酸合成酶（Fd-GOGAT）活性测定：称取约0.1 g组织，用1 mL提取缓冲液（100 mM PBS，pH 7.4，含EDTA和β-巯基乙醇）在冰浴中匀浆。在4°C下10000 rpm离心10 min，收集上清液并置于冰上待测。酶标仪预热至少30 min，波长设置为450 nm。在EP管中混合100 μL谷氨酰胺溶液、100 μL α-酮戊二酸溶液和50 μL甲基紫精溶液，充分混匀，然后在30°C下孵育5 min。转移50 μL上清液与50 μL碳酸氢钠-连二亚硫酸钠溶液混合。空白对照加入50 μL蒸馏水代替。反应混合物在30°C下准确孵育30 min，然后在95°C加热5 min终止反应。冷却后，在4°C下10000 rpm离心5 min，收集上清液进行分析。在微孔板中加入20 μL上清液和180 μL工作液，混匀，在25°C下孵育30 min。测量每个孔在450 nm处的吸光度（A），并计算ΔA = A_样品 ? A_空白。

数据分析和图表绘制使用Microsoft Excel 2015、SPSS 20.0和Origin 2021进行。本试验中，每个肥料处理布置在两个独立的田间小区（真实生物学重复）。每个小区内随机选取3株植株进行测量，得到6个原始数据点。

3 结果与分析

对两年间不同氮处理下两种水稻产量类型的谷物产量进行方差分析（ANOVA）。结果表明：品种和氮处理间存在极显著差异（p < 0.01）；对于互作效应，除年份×品种、年份×氮处理外，所有因子组合均达到极显著水平；年份间无显著差异（p > 0.05），表明两个试验年份产量重复性良好。这些结果证明了可靠准确性和代表性，真实反映了不同产量类型水稻基因型的产量差异，因此适合进一步分析。

两种栽培类型的谷物产量均在最高氮水平（N3: 315 kg·ha^?1）下达到峰值，且氮处理间存在显著差异。2023年，高产品种（HYV）在N3下的产量比低氮（N1: 225 kg·ha^?1）和中氮（N2: 270 kg·ha^?1）处理分别高出7.07%和3.07%。LYV响应更强烈，产量增幅分别为13.01%（N3 vs. N1）和6.00%（N3 vs. N2）。产量构成分析显示，与N1相比，N3使HYV和LYV的有效穗数分别增加4.73%和12.12%，每穗粒数分别增加6.53%和2.41%；与N2相比，每穗粒数分别增加6.05%（HYV）和4.10%（LYV）。N3下的千粒重（TGW）比N1下分别高3.91%（HYV）和1.11%（LYV）。在所有氮处理下，HYV始终保持比LYV多4.84%–5.23%的有效穗数、高2.37%–2.51%的结实率和重20.65%–20.68%的TGW，但每穗粒数和单位面积总小穗数较低。

随着氮供应增加，水稻的氮积累量（NA）和总氮转运量（TNT）均显著增加，而转运氮比例（PTN）总体下降，但HYV茎秆的氮转运比例（PTNS）在抽穗至成熟期呈上升趋势。2023年，HYV和LYV在N3下的NA分别比N1下高19.39%和20.58%。在相同氮水平下，HYV在成熟期营养器官（茎秆和叶片）中保持较高的NA，分别比LYV高29.04%–30.75%和26.94%–27.96%。这些器官在抽穗至成熟期间转运的氮量也显著高于LYV，增幅达16.72%–21.43%。HYV的PTNS随氮水平增加而增加，而LYV则下降。因此，LYV在齐穗至成熟期表现出更高的叶片（PTNL）和茎秆（PTNS）氮转运比例，分别比HYV优势2.18%–2.65%和11.66%–11.80%。

提高氮供应持续降低了水稻的所有氮利用效率指标。氮干物质生产效率（NDMPE）、氮偏生产力（NPKI）、氮转运贡献率（CRNT）和氮转运效率（NTE）均显著下降。2023年，HYV在N3下的NDMPE、NPKI、CRNT和NTE分别比N1下低15.16%、30.09%、4.88%和3.48%。LYV的相应降幅为11.70%、21.79%、5.77%和9.11%。谷物氮利用效率（NUEg）和氮收获指数（NHI）也随氮水平增加而下降。 across all N levels, HYV maintained 4.39%–5.62% higher NDMPE and 17.49%–19.24% higher NPKI than LYV, whereas its CRNT and NTE were 8.68%–8.84% and 3.85%–5.09% lower, respectively.

NR催化硝酸盐转化为铵的限速步骤。图2展示了HYV和LYV在三种氮 regime 下抽穗后0、22和44天（DAH）的叶片NR活性。无论品种如何，增加氮供应显著增强了NR活性。在N3下，HYV在0、22和44 DAH的NR活性分别比N1下高24.58%、14.69%和72.09%；LYV的相应增幅为36.57%、46.46%和57.71%。在整个灌浆期，HYV在N3下保持优于LYV的NR活性，在0、22和44 DAH分别优势4.25%、44.92%和43.68%。NR活性随时间显著下降：在N3下，HYV和LYV的活性在0至44 DAH间分别下降25.66%和56.28%。值得注意的是，HYV的下降仅在44 DAH才变得显著，而LYV在22 DAH时已急剧下降。

水稻氮同化和积累主要由谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶（GS/GOGAT）循环介导。提高氮供应显著增强了两个品种在成熟期的叶片GOGAT活性（图3a,b）。在整个灌浆期，HYV始终保持比LYV更高的GOGAT活性。在N3下，HYV在0、22和44 DAH的GOGAT活性分别比LYV高34.46%、43.92%和63.78%。叶片GOGAT活性随时间逐渐下降；从0到44 DAH，N3下的降幅在HYV中总计为19.32%，在LYV中为55.42%。

在整个灌浆期，HYV的可溶性蛋白浓度随氮供应增加而上升。在0 DAH，N3使叶片和茎秆中的可溶性蛋白分别比N1下高11.64%和42.16%；在44 DAH，相应增幅分别为15.51%和18.84%（叶片）以及14.75%和65.16%（茎秆）。在LYV中，响应仅在22 DAH显著，当时N3使叶片和茎秆可溶性蛋白分别比N1下高33.33%和21.36%。HYV在所有采样时间均保持比LYV更高的可溶性蛋白水平。在叶片中，HYV across the three N treatments 在0 DAH比LYV高39.67%–44.13%，在22 DAH高21.0%–30.2%，在44 DAH高29.69%–31.66%。在茎秆中，HYV在0 DAH under N1 and N2 低于LYV（分别为-8.60%和-0.69%），但在N3下更高（15.89%）；在22 DAH，HYV优势37.16%–45.08%，在44 DAH优势0.99%–29.02%。两个器官的可溶性蛋白含量均逐渐下降。从0到44 DAH，HYV的降幅为53.87%（叶片）和48.94%（茎秆），而LYV下降39.53%（叶片）和53.69%（茎秆）（图4）。

图5a,b展示了HYV和LYV在整个灌浆期的叶片Fd-GOGAT活性。氮供应在0和22 DAH显著影响Fd-GOGAT活性。在N3下，HYV在0和22 DAH的值分别比LYV低16.31%和41.86%，但在44 DAH高14.67%。两个品种的Fd-GOGAT活性均逐渐下降，从0到44 DAH的降幅在N3下HYV中为42%，LYV中为57.45%。

为阐明水稻产量、氮利用效率（NUE）和灌浆期关键酶活性之间的相互作用，我们进行了全面的相关性分析。如图6a所示，水稻产量与齐穗期叶片氮积累量（FHS）、营养器官总氮转运量、氮积累量呈显著正相关，与成熟期茎秆氮积累量呈极显著正相关；与氮转运贡献率呈极显著负相关。如图6b所示，产量与0 DAH叶片可溶性蛋白浓度、44 DAH叶片可溶性蛋白浓度、22 DAH茎秆可溶性蛋白浓度、0 DAH叶片GOGAT酶活性、22 DAH叶片GOGAT酶活性、22 DAH叶片NR酶活性呈极显著正相关（p < 0.01）；0 DAH叶片GOGAT酶活性与0 DAH叶片可溶性蛋白浓度、22 DAH茎秆可溶性蛋白浓度、22 DAH叶片GOGAT酶活性、22 DAH叶片NR酶活性呈极显著正相关（p < 0.01）。22 DAH叶片GOGAT酶活性与0 DAH叶片可溶性蛋白浓度、22 DAH茎秆可溶性蛋白浓度、0 DAH叶片GOGAT酶活性、22 DAH叶片NR酶活性呈极显著正相关（p < 0.01）。22 DAH叶片NR酶活性与0 DAH叶片可溶性蛋白浓度、22 DAH茎秆可溶性蛋白浓度、0 DAH叶片GOGAT酶活性、22 DAH叶片GOGAT酶活性呈极显著正相关（p < 0.01），与44 DAH叶片可溶性蛋白浓度呈显著正相关（p < 0.05）。

4 讨论

先前研究表明，施氮量强烈影响水稻产量和氮利用效率（Yang et al. 2025）。为剖析 contrasting yield genotypes 的差异氮响应机制，我们进行了为期2年的田间试验，让两种产量型栽培种——高产品种（HYV）和低产品种（LYV）在三种氮水平下生长。谷物产量随氮供应增加而显著增加，但相对增量在LYV中始终大于HYV。李国辉（Li et al. 2024）在近等基因高产和低产品系中报道了类似模式：高产品系的产量优势随氮水平增加而减弱，而低产品系表现出更陡峭的响应。增施氮肥提高了HYV和LYV的单位面积穗数和千粒重。在扬州地区，灌溉水稻的产量平台通常在250–260 kg N·ha^?1达到（Ju et al. 2021）。从N1到N3观察到的谷物产量、每穗小穗数和千粒重的持续增加可能表明品种特异性氮吸收上限尚未达到，或者所施氮梯度略微超过最佳水平，但未引起产量低于N2水平的下降。尽管LYV产生更多的每穗小穗数和更高的穗密度，但其较低的千粒重最终限制了产量 relative to HYV。

水稻氮利用效率反映了氮吸收、转运和同化以驱动生长的综合能力（Li, Wen, et al. 2025; Li, Zhang, et al. 2025）。氮利用效率表示水稻将吸收的氮同化为含氮化合物用于植物生长和代谢的能力（Kim et al. 2025）；谷物氮生产效率和氮干物质生产效率反映了水稻氮利用效率。水稻氮吸收能力，特别是成熟期氮积累及随后向籽粒的氮转运，是产量和氮利用效率的关键决定因素（Zhang et al. 2025）。在本研究中，增加氮供应显著增强了氮转运。LYV在谷物氮生产效率和氮收获指数上的降幅大于HYV，表明LYV的氮利用效率对氮水平更敏感，这与Ju et al.（2021）一致。灌浆期是决定最终粒重并 consequently 水稻产量的关键发育窗口（Zhang et al. 2021）。在此期间，叶片氮在光合结构的维持和向籽粒再动员以合成储存蛋白之间进行分配，创造了持续光合速率和增强氮再动员之间固有的生理权衡（Chen and Mi 2018）。在本研究中，产量与总氮转运量（TNT）呈显著正相关，但与氮转运贡献率（CRNT）呈高度负相关。尽管LYV表现出比HYV更高的CRNT和更高的氮转运效率（NTE），但这一明显优势被较差的整株氮吸收和较低的总氮积累所抵消。因此，高效获取土壤氮并将其随后转化为谷物质量是高产水稻的决定性属性（Li et al. 2024）。

灌浆期氮代谢酶活性是水稻氮利用效率和最终产量的主要决定因素（Ahmad et al. 2025）。根系吸收的无机氮必须首先被同化，然后才能并入氨基酸、蛋白质和其他含氮代谢物（Bingham et al. 2012）；硝酸还原酶（NR）催化该途径的限速步骤（Ismail et al. 2025）。在本实验中，提高氮供应显著增强了整个灌浆期的叶片NR活性。在N3 regime下，HYV保持比LYV更高的NR活性；从抽穗后0到44天（DAH），NR活性的下降在HYV中也较小。NR活性的显著抑制仅在HYV的44 DAH发生，而LYV在22 DAH时已表现出明显下降。受损的NR活性 disrupts 氮同化（Zhang et al. 2025），限制叶绿素合成，降低光合速率，从而减少干物质积累和谷物产量（Gao et al. 2019），这一模式通过高产和低产品种的近等基因比较得到证实（Li, Wen, et al. 2025; Li, Zhang, et al. 2025）。谷氨酸合成酶（GOGAT）是氨基酸生物合成的关键酶（Zheng 2009），不仅为灌浆提供氨基酸，还将光呼吸产生的甘氨酸回收为谷氨酸（Lu et al. 2011），从而整合碳氮代谢，促进籽粒饱满和产量。在整个灌浆期，旗叶中的GOGAT活性始终保持HYV高于LYV；在N3下，GOGAT活性的年龄相关下降在HYV中相对于LYV显著减弱。

可溶性蛋白是合成具有特定空间结构的功能蛋白的前体物质。较高的可溶性蛋白浓度表明蛋白质合成前体供应充足，反映了植株内强大的合成代谢能力。在齐穗期，水稻茎秆和叶片可暂时储存可溶性蛋白，为后续氮向籽粒的再分配提供物质基础，有助于高产形成（Qi et al. 2024）。增加氮肥施用促进水稻叶片叶绿素合成（Song et al. 2025），使植株通过光合作用固定更多二氧化碳并产生更多有机物质。这些有机物质为可溶性蛋白合成提供了丰富的碳骨架。当与氮代谢产生的氨基酸结合时，它们建立了“碳氮代谢耦合”（Liu et al. 2025），从而促进可溶性蛋白含量的增加。HYV通常具有更高的氮吸收效率和氮同化效率，使其能够将更多氮转化为可溶性蛋白（Cong et al. 2023）。提高氮施用量显著增加了所有处理的可溶性蛋白浓度。在N3 regime下，HYV在0、22和44 DAH的旗叶中保持比LYV更高的可溶性蛋白含量。HYV表现出更快的氮吸收能力和更高效的将同化氮再动员到籽粒的能力，而LYV表现出相对较低的吸收和输出速率。因此，更大比例的氮暂时保留在LYV的叶片中。为促进随后将这种叶片储存的氮转移至发育中的籽粒，LYV需要在0和22 DAH时更高的Fd-GOGAT活性。Zeng et al.（2017）表明，Fd-GOGAT对于珍汕34及其gogat1突变体叶片衰老期间的氮再动员至关重要。Wang et al.（2018）观察到，OsARE1（Fd-GOGAT阻遏物）启动子中的一个小indel多态性在高产品种中显著富集；该等位基因减弱OsARE1表达，从而在灌浆后期维持升高的Fd-GOGAT转录水平。增强的Fd-GOGAT活性加速谷氨酸合成，这是谷胱甘肽的前体，从而 potentiate 谷胱甘肽-抗坏血酸循环。该循环增强了植物的抗氧化能力并减弱MDA积累（Ma et al. 2015）。SAG12，一个典型的衰老相关基因，被广泛认为是植物衰老的可靠分子标记，其表达水平与叶片衰老进程紧密相关（Subaran et al. 2016）。因此，升高的Fd-GOGAT活性可能抑制SAG12表达，从而延缓叶片衰老，建立“高活性→减少氧化应激→