大豆PPR基因SST1的自然变异赋予耐盐性并揭示驯化中的选择机制

本研究通过全基因组关联分析（GWAS）鉴定出大豆耐盐关键基因SST1，该基因编码线粒体定位的五肽重复（PPR）蛋白，通过调控RNA编辑（cob、nad3、atp6-1）影响线粒体形态与H2O2稳态。截短等位基因SST1HapT在栽培大豆中固定存在，与GmCHX1协同调控盐耐受，为耐盐育种提供新靶点。

　　

1 引言

土壤盐渍化是制约大豆幼苗生长和产量的重要环境因子。大豆作为中等盐敏感作物，当土壤电导率超过5 dS/m时即出现显著减产。盐胁迫通过抑制光合作用、共生固氮和营养吸收等过程影响大豆生命周期，并导致活性氧（ROS）积累和细胞损伤。尽管已发现GmNHX1、GmCHX1等离子通道蛋白和GmNTL1等转录因子参与盐响应，但大豆庞大的基因组仍蕴藏大量未挖掘的耐盐遗传位点。

野生大豆（Glycine soja）与栽培种（Glycine max）存在显著的耐盐性差异，其中染色体3上的GmCHX1（又称GmSALT3）是已知主效QTL，可解释41%-60%的表型变异。该基因的Ty1/copia转座子插入会导致功能缺失和耐盐性降低。近年来通过全基因组关联研究（GWAS）进一步发现GmCDF1和GsERD15B等基因的自然变异与耐盐性相关，表明GWAS是挖掘耐盐基因的有效手段。

2 结果

2.1 基于GWAS的大豆耐盐位点鉴定

研究利用240份大豆核心种质资源，通过盐诱导叶片衰老（SILS）表型评估系统进行耐盐性筛选（图1d）。GWAS分析在染色体3和9上分别检测到主效和次效QTL信号（图1e），其中染色体3峰值与已知的GmCHX1位点重合，验证了筛选系统的可靠性。染色体9上117.19 kb区域内共10个显著SNP（p<1×10^-5）覆盖Glyma.09G000400、Glyma.09G000700和Glyma.09G001200三个候选基因。通过毛根转化过表达实验发现，仅Glyma.09G000400过表达会增强盐敏感性，故将其命名为SST1（图S3）。在ZH13基因组中重新比对验证了该位点的显著性（图S4）。

2.2 SNP24932导致SST1转录本提前终止

SST1编码含DYW结构域的PLS亚类PPR蛋白。关联分析显示外显子区SNP24932（C-to-T）与耐盐性关联最强（p=3.53×10^-8），该突变导致提前出现终止密码子，产生仅232个氨基酸的截短蛋白（图2a-c）。单倍型分析将199份种质分为Hap1-4四组，其中Hap2（截短型）耐盐性显著高于其他组（图2b）。Western blot验证HapC/Hap3产生70 kDa全长蛋白，而HapT/Hap2仅产生26 kDa截短蛋白（图2c）。毛根互补实验表明过表达SST1^HapC会降低耐盐性，而SST1^HapT无此效应（图2d-g）。

2.3 SST1是耐盐性的负调控因子

通过CRISPR/Cas9获得sst1-1（1-bp缺失）和sst1-2（4-bp缺失）突变体（图S8）。盐胁迫下突变体SILS评分、株高和叶片鲜重显著高于野生型（WT），且叶片Na⁺/K⁺比降低而根部该比值升高（图3a-e）。突变体内脯氨酸、可溶性糖含量增加而MDA含量降低，根部H₂O₂积累更显著（图3f-g，图S9）。qPCR显示盐胁迫下突变体中GmNHX1、GmSOS1、GmSIN1、GmNCED3s和GmRbohBs等基因表达显著上调（图3h）。双突变体实验表明SST1的耐盐调控效应强于其旁系同源基因（图S12）。

2.4 SST1线粒体定位与蛋白水平盐响应

SST1转录水平不受盐胁迫影响（图4a），但其蛋白水平在盐处理9小时后显著下降，24小时恢复（图4b-c）。亚细胞定位显示SST1¹⁰⁶-GFP与线粒体标记共定位（图4d），其N端含27个氨基酸的线粒体靶向信号（图S16）。GUS染色证实启动子活性不受盐诱导（图S15）。

2.5 SST1调控线粒体RNA编辑与形态

SST1与拟南芥AT5G50390同源，预测参与RNA编辑。测序分析发现sst1-1突变体中cob-C113、nad3-C230和atp6-1-C167位点的编辑效率显著降低（图5a）。酵母双杂和CoIP实验证实SST1与GmMORF1b互作（图5b-c）。电镜观察显示突变体线粒体体积变小，嵴结构肿胀且出现囊泡状结构（图5d-f）。复合物活性检测发现突变体中线粒体复合物IV活性降低，ATP合成能力减弱（图S19）。

2.6 SST1调控的转录组网络

RNA-seq分析发现盐胁迫下sst1-1突变体有3591个核基因组DEGs（2050个上调，1541个下调），显著多于WT的1135个DEGs（图6a-b）。GO分析显示这些基因富集于离子运输、氧化还原和缺氧响应等过程（图6d-e）。线粒体基因组有7个DEGs，其中atp6-1、atp1-1等复合物V基因在突变体中显著上调（图6i-j）。

2.7 SST1的驯化选择与地理分布

群体遗传分析显示SST1所在44.2 kb区域存在强烈选择信号（图7a）。SNP24932的T等位基因在地方品种中出现，在育成品种中固定，表明其在大豆改良中被正向选择（图7b）。地理分布显示Hap2型品种显著富集于盐渍土壤区域（图7c）。单倍型网络分析表明栽培种中Dom-SST1^T可能源自野生大豆的基因渗入（图7e-g），渗入事件最可能发生在黄淮地区（图7h）。

2.8 SST1与GmCHX1的协同调控

基因型组合分析显示GmCHX1/sst1组合耐盐性最强，gmchx1/SST1组合最敏感（图8a）。GmCHX1的耐盐效应强于SST1，但两者存在加性效应。群体分析表明SST1受驯化选择而GmCHX1无明显选择痕迹（图8b）。

3 讨论

本研究首次发现PPR蛋白SST1通过调控线粒体RNA编辑影响大豆耐盐性。截短等位基因SST1^HapT的功能缺失突变通过降低cob、nad3和atp6-1的编辑效率，改变线粒体形态和ROS稳态，从而增强耐盐性。该等位基因在栽培大豆中的固定反映了驯化过程中对盐渍环境的适应。SST1与GmCHX1的协同作用为耐盐育种提供了多重靶点。

4 材料与方法

研究采用240份大豆种质进行SILS表型评估，通过GWAS（MLM模型）鉴定耐盐位点。利用毛根转化、CRISPR/Cas9编辑、Western blot、电镜观察、RNA-seq和Y2H等技术验证基因功能。群体遗传分析采用VCFtools和基因渗入检测方法。