基于PCR方法的罐装金枪鱼种类检测方法比较

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Comparison of PCR-Based Methods for the Detection of Canned Tuna Species

罐装金枪鱼因需求大、供应链复杂易导致物种标签错误，DNA降解使传统条形码法（CR迷你条形码）检测率仅33%。本研究比较CR迷你条形码、实时PCR和多重PCR三种方法，发现实时PCR检测率100%，多重PCR29%，CR迷你条形码33%。实时PCR因靶向短DNA片段（<100bp）在降解样本中表现优异，但无法区分近缘种（如蓝鳍与黄鳍金枪鱼）。CR迷你条形码虽成本高时效长（$18/样本，2天），但能通过测序确认混合物种。建议联合使用实时PCR快速筛查和CR迷你条形码测序确认，兼顾效率和准确性。

　　近年来，随着全球对金枪鱼需求的增加，金枪鱼产品的标签问题日益严重。金枪鱼因其广泛的消费群体和复杂的供应链，成为食品欺诈和标签不实的高发领域。为了应对这一挑战，科学家们一直在探索更为可靠和高效的检测方法，以确保消费者获得准确的产品信息。本研究旨在比较两种常见的分子检测技术——基于线粒体控制区（CR）的DNA条形码技术（CR mini-barcoding）和靶向聚合酶链式反应（PCR）方法（包括实时PCR和多重PCR）在金枪鱼产品中的应用效果，以确定最适合用于罐装金枪鱼物种鉴定的方法。

金枪鱼作为一种重要的海洋资源，其全球年捕捞量高达830万吨（FAO, 2024）。在美国，金枪鱼是主要的进口海鲜之一，2020年的进口量接近30万吨，其中约71%为罐装金枪鱼（NMFS, 2022）。罐装金枪鱼在美国的消费量位居第三，其中以“轻金枪鱼”和“白金枪鱼”（即阿拉科尔金枪鱼）为主（NFI, 2024a, b）。然而，由于罐装过程中需要高温和高压处理，导致DNA严重降解，这使得传统的DNA条形码技术难以有效应用于这类产品。因此，研究人员开发了更短的DNA片段检测方法，如CR mini-barcoding，以提高检测的可行性。

CR mini-barcoding方法利用线粒体控制区的短片段进行物种鉴定，已被广泛用于金枪鱼的分类（Cawthorn et al., 2011; Mitchell and Hellberg, 2016; Roungchun et al., 2022; Vi?as and Tudela, 2009）。然而，该方法在罐装金枪鱼中的检测率相对较低，仅在33%的样本中成功识别出物种。相比之下，实时PCR方法在所有24个罐装样本中均实现了100%的检测率，且在混合样本中表现出更高的灵敏度，能够检测出低至0.1%的靶向物种。多重PCR方法的检测率为29%，虽然与实时PCR的检测效果相近，但在成本和时间上具有一定的优势。具体而言，多重PCR和实时PCR的每样本成本均为6美元，检测所需总时间为3至6小时，而CR mini-barcoding则需要更高的成本（每样本18美元）和更长的时间（约2天），尽管其能够提供更全面的遗传信息。

研究中使用的样本涵盖了四种主要的罐装金枪鱼类型：阿拉科尔金枪鱼、skipjack金枪鱼、黄鳍金枪鱼和轻金枪鱼。这些样本通过双份DNA提取进行分析，并分别使用CR mini-barcoding、多重PCR和实时PCR方法进行检测。DNA提取过程采用DNeasy Blood and Tissue Kit进行，确保了提取过程的标准化和重复性。PCR反应条件根据不同的方法进行调整，以优化检测效果。例如，CR mini-barcoding的PCR扩增和测序步骤需要特定的引物和反应体系，而多重PCR和实时PCR则分别使用不同的引物组合和荧光探针技术，以实现多重检测和实时监控。

在检测结果方面，CR mini-barcoding在罐装金枪鱼样本中成功识别了8个样本，其中3个为阿拉科尔金枪鱼，3个为黄鳍金枪鱼，1个为蓝鳍金枪鱼，1个为大眼金枪鱼。这些结果表明，尽管CR mini-barcoding在某些情况下能够提供准确的物种信息，但其在skipjack和轻金枪鱼样本中的成功率较低，这可能与DNA降解程度较高以及引物结合效率较低有关。相比之下，多重PCR在7个样本中成功识别了物种，主要为黄鳍金枪鱼和阿拉科尔金枪鱼，而实时PCR则在所有样本中均成功检测到物种，并且在混合样本中表现出更高的灵敏度，能够在低至0.1%的靶向物种浓度下准确识别。

此外，研究还测试了实时PCR方法在二元物种混合样本中的表现。结果显示，实时PCR能够检测到低至0.1%的靶向物种，无论是新鲜样本还是模拟罐装条件下的样本。这一结果表明，实时PCR不仅在单一物种检测中表现出色，而且在混合物种的检测中也具有较高的灵敏度和准确性。相比之下，多重PCR在低浓度混合样本中的检测效果较差，尤其是在0.1%的混合比例下，仅能在33%的样本中检测到目标物种。这可能与多重PCR方法中引物之间的竞争性以及PCR产物的电泳分析难度有关。

在方法的实用性和效率方面，实时PCR因其操作简便、成本较低以及检测速度快，成为首选的检测手段。而CR mini-barcoding虽然提供了更详细的遗传信息，但其操作复杂性较高，且需要额外的测序步骤，增加了时间和经济成本。多重PCR则在检测效率和成本之间取得了一定的平衡，但其在某些情况下仍难以达到理想的检测效果。因此，研究建议在实际应用中，结合使用实时PCR和CR mini-barcoding方法，以实现快速筛查和序列验证的双重目的。

本研究的发现对于食品安全监管和消费者保护具有重要意义。通过准确识别罐装金枪鱼的物种组成，可以有效防止因标签不实而导致的健康风险，例如汞中毒。同时，这一方法也有助于打击非法捕捞和不规范的贸易行为，保护濒危和受威胁的金枪鱼种群。尽管CR mini-barcoding方法在某些情况下表现不佳，但其提供的遗传信息对于进一步的物种确认和研究具有不可替代的价值。

在实际应用中，研究人员应考虑优化CR mini-barcoding方法，以提高其在罐装金枪鱼中的检测成功率。此外，引入其他遗传标记或改进测序技术，也可能有助于提高检测的准确性和效率。未来的研究可以探索更高效的PCR反应条件、更优化的引物设计以及更快速的测序技术，以应对罐装金枪鱼中DNA降解的挑战。通过这些方法的结合和优化，可以实现对金枪鱼产品更全面、更精确的物种鉴定，从而提升食品安全标准和监管效率。