乳酸菌伊氏乳杆菌484株的表型与遗传特征及其生产能力——一种从人乳中分离出的新型益生菌菌株

《Food Science & Nutrition》：Phenotypic and Genetic Characterization and Production Abilities of Lacticaseibacillus rhamnosus Strain 484—A New Probiotic Strain Isolated From Human Breast Milk

人类母乳中的乳酸杆菌（L. rhamnosus）484菌株经表型和基因组分析，证实其具备益生菌特性：高自/共凝聚能力（15.38%/57.65%）、耐胆盐（0.1%-1.0%浓度）、低pH耐受（pH 3.0以上），无溶血和过氧化氢酶活性，基因组无抗生素抗性基因和质粒，且表面亲脂性（接触角90.07°）显著高于LGG参考菌株，表明更强的肠道粘附能力。该菌株在抑制大肠杆菌、链球菌等病原体方面效果显著（最高84.3%抑制率），并具有规模化培养潜力（3.0×10^9 CFU/mL）。

　　近年来，人类乳汁（HBM）作为益生菌来源的研究日益受到关注，其在医学和食品工业中的应用潜力备受期待。益生菌，尤其是乳酸菌属（Lactobacillus）的菌株，因其能够促进宿主健康、抑制有害病原体等特性而被认为具有广泛的益生特性。然而，值得注意的是，并非所有乳酸菌菌株都具有相同的健康益处，其益生特性具有菌株特异性。因此，对于新分离的菌株，必须进行全面的表型和基因组分析，以评估其作为益生菌的潜力。本研究针对从人类乳汁中分离出的新型乳酸菌菌株Lacticaseibacillus rhamnosus 484进行了系统评估，探讨其在医学和食品工业中的潜在应用价值。

Lacticaseibacillus rhamnosus 484是从波兰?wi?tokrzyskie地区健康女性的乳汁中分离得到的，随后被保存在波兰微生物收藏中心（PCM），并被赋予编号B/00379。该菌株被归类为乳酸菌（LAB）中的一种，具有典型的乳酸菌特征。为了评估其益生特性，我们采用了一系列实验方法，包括表型分析、基因组测序和对抗生素敏感性的检测。这些研究不仅有助于理解菌株的生物学特性，也为进一步开发其在健康促进和疾病预防中的应用提供了科学依据。

在表型分析方面，我们重点考察了菌株的自聚集（auto-aggregation）和共聚集（co-aggregation）能力。这两种特性对于益生菌的存活和病原体排斥至关重要。实验结果表明，L. rhamnosus 484具有显著的自聚集能力，其自聚集率达到了15.38%。在与大肠杆菌（E. coli）的共聚集实验中，菌株表现出57.65%的共聚集率，显示出良好的与病原体结合的能力。这种特性可能有助于其在肠道中形成稳定的微生物群落，并在竞争中有效抑制病原菌的生长。

除了聚集能力，我们还对菌株的耐胆盐能力和低pH环境下的生存能力进行了评估。结果显示，L. rhamnosus 484在不同浓度的胆盐（0.1%至1%）环境中均能存活，表明其具有较强的肠道适应能力。此外，该菌株在pH 2.0条件下无法生长，但在pH 3.0及以上环境中表现出良好的耐受性，进一步支持其作为益生菌在口服应用中的可行性。菌株还显示出较高的乳酸生产能力，相较于常用的L. rhamnosus GG（LGG）菌株，其乳酸产量达到14.11 mg/mL，这表明其具有良好的代谢活性和产酸能力，有助于维持肠道环境的酸性，从而抑制有害微生物的生长。

在安全性评估方面，我们对菌株的溶血活性和过氧化氢酶活性进行了测试。溶血活性是判断益生菌是否安全的重要指标之一，因为它可能导致细胞损伤。实验结果显示，L. rhamnosus 484在含羊血的培养基上未表现出溶血活性，这表明其在体内具有较低的潜在毒性。同样，该菌株在过氧化氢测试中未表现出催化活性，进一步确认了其安全性。此外，菌株在基因组分析中未发现任何抗生素耐药基因（ARGs）或质粒，说明其基因组结构稳定，不具备潜在的抗生素耐药性。

我们还对菌株的表面疏水性（CSH）和生物膜形成能力进行了研究。表面疏水性是益生菌黏附和定植肠道的重要因素，而生物膜的形成则有助于其在肠道中建立长期的微生物屏障。实验结果显示，L. rhamnosus 484的表面疏水性显著高于LGG菌株，表明其在肠道中具有更强的黏附能力。同时，通过荧光显微镜和ImageJ软件对生物膜的分析，显示该菌株能够形成稳定的生物膜结构，这可能有助于其在肠道中的持久性和抗菌能力。

在基因组分析中，我们使用了Galaxy平台和Unicycler工具进行基因组组装，并通过Bakta Web平台进行基因组注释。结果表明，该菌株的基因组包含丰富的功能基因，包括59个tRNA基因、15个rRNA基因以及多个非编码RNA基因，这些基因可能在调控基因表达和细胞代谢中发挥重要作用。此外，我们还检测到了CRISPR序列，表明该菌株具备抵御外来遗传物质的能力，这可能有助于其在宿主环境中的适应性。同时，基因组中未发现质粒复制起始位点（oriV），进一步确认了其基因组的稳定结构，表明其在工业和食品应用中具有较高的安全性。

通过对抗生素敏感性测试，我们评估了菌株在面对不同抗生素时的反应。结果显示，L. rhamnosus 484对多种抗生素表现出高度敏感性，包括针对细胞壁合成的抗生素和针对蛋白质合成的抗生素。这种敏感性不仅说明该菌株本身不具备耐药性，也表明其在对抗耐药病原体方面可能具有潜在的协同作用。此外，通过移动遗传元件（MGEs）的检测，我们发现该菌株中存在多种插入序列（ISs）和复合转座子，但未发现任何潜在的危险因子，这进一步支持了其作为益生菌的安全性。

在抗微生物活性方面，我们评估了L. rhamnosus 484对七种病原菌的抑制能力。实验结果显示，该菌株对多种病原菌表现出显著的抑制效果，其中对大肠杆菌ATCC 25922的抑制率高达84.3%，对链球菌的抑制效果也表现出较强的广谱抗菌能力。这些结果表明，L. rhamnosus 484可能通过其代谢产物或非编码基因产物实现抗菌作用，而非仅仅依赖于有机酸或过氧化氢等传统机制。此外，通过antiSMASH工具对菌株的次级代谢产物进行了分析，发现其基因组中存在多个与次级代谢产物合成相关的基因簇，这些代谢产物可能具有广泛的抗菌活性，从而增强了菌株的抗菌能力。

在菌株的生产潜力方面，我们测试了五种商业化的培养基对L. rhamnosus 484的生长影响。结果显示，不同的培养基对菌株的生长效果存在显著差异，其中培养基1的生长效果最佳，达到1.0×10¹⁰ CFU/mL。培养基3在工业规模培养中表现出良好的应用潜力，其能够实现稳定的菌体浓度（3.0×10⁹ CFU/mL），表明该菌株在实际生产中具有可行性。

综上所述，L. rhamnosus 484作为一种从人类乳汁中分离出的益生菌，展现了广泛的益生特性，包括抗菌能力、安全性、表面疏水性和生物膜形成能力。这些特性使其成为一种具有应用前景的益生菌候选菌株，可能在食品和医学领域发挥重要作用。然而，尽管本研究展示了该菌株的优良特性，仍需进一步研究其具体的抗菌机制、表面特性对肠道黏附的影响以及与其他益生菌的协同作用，以实现其在实际应用中的优化和推广。