综述：环状RNA介导的心血管疾病关键信号通路调控机制

《Journal of Advanced Research》：Circular RNA-mediated regulation of key signaling pathways in cardiovascular diseases: a review

本综述系统探讨了环状RNA（circRNA）在心血管疾病（CVD）中的调控作用与治疗潜力。文章详细解析了circRNA的生命周期（包括生物合成、核输出、亚细胞定位与降解机制），功能多样性（如miRNA海绵、蛋白互作、转录调控与多肽翻译），以及最新工程化进展（体外合成、递送系统、疫苗开发与基因编辑工具）。重点阐述了circRNA通过调控TGF-β、Wnt/β-catenin、NF-κB、PI3K/AKT/mTOR（PAM）和Hippo/YAP等核心信号通路影响心血管病理进程的分子机制，为circRNA作为生物标志物和精准治疗靶点提供了理论依据。

　　

环状RNA的生物学特征与代谢机制

环状RNA（circRNA）是一类通过前体mRNA反向剪接形成的共价闭合单链RNA分子，缺乏5′端帽结构和3′端多聚腺苷酸尾，因此比线性mRNA具有更高的稳定性。根据来源基因组区域的不同，circRNA可分为内含子来源circRNA（ciRNA）、外显子-内含子circRNA（EIciRNA）、外显子来源circRNA（ecircRNA）和线粒体编码circRNA（mecciRNA）四大类。大多数内源性circRNA由多个外显子组成并定位于细胞质，而EIciRNA和ciRNA主要位于细胞核内。

circRNA的生物合成主要依赖四种模型：内含子配对驱动环化、RNA结合蛋白（RBP）介导环化、套索驱动环化以及核酶介导环化。QKI和RBM20等RNA结合蛋白通过调节前体mRNA结构和剪接动力学，精确调控心脏特异性circRNA的生成。表观遗传修饰如m⁶A甲基化、组蛋白修饰和启动子相关表观遗传变化也影响反向剪接过程。

circRNA的亚细胞定位与其功能密切相关。许多circRNA在细胞核中生成后被输出到细胞质发挥调控作用，其核输出机制包括长度依赖性核输出、m⁶A修饰依赖性途径和细胞外外泌体介导的运输。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（IGF2BP1）直接结合circRNA并招募Ran-GTP和exportin-2，形成类似于蛋白质运输的专门化circRNA输出机制。核输出因子4（XPO4）缺失会导致ecircRNA在核内积聚，引发R环形成、DNA损伤及下游表型如不育和神经发育障碍。

circRNA的降解是一个关键的代谢调控环节。RNase H1可降解形成circRNA-DNA杂交结构（circR环）的circRNA；先天免疫激活（如聚肌胞苷酸刺激或病毒感染）后，RNase L会全局降解circRNA。DIS3内切核酸酶通过识别U-rich基序选择性降解全转录组中的circRNA，这一发现揭示了circRNA稳定性的新调控途径。线粒体RNA解旋酶SUPV3L1与内切核酸酶ELAC2共同介导mecciRNA的快速降解，这些circRNA调控线粒体ROS和线粒体通透性转换孔（mPTP）活性。

分子功能多样性：从调控机制到治疗潜力

circRNA通过多种分子机制在疾病调控中发挥重要作用，包括作为miRNA海绵、蛋白质海绵、支架、诱饵或招募器，介导转录调控，参与多肽翻译，以及进行RNA或DNA相互作用。

作为miRNA海绵是circRNA最特征化的分子功能。大多数定位于细胞质的circRNA含有多个miRNA反应元件（MRE），作为竞争性内源RNA（ceRNA）通过竞争性结合miRNA特定位点来调节基因表达。在心血管研究中，circHMGCS1、circ_0008362、circMAP3K5、circCHSY1和hsa_circ_0001402等circRNA介导的miRNA海绵作用为CVD治疗提供了潜在靶点。

circRNA与蛋白质的动态相互作用更为直接。它们通过支架、隔离、亚细胞重分布和复合物形成等多种机制调节蛋白质-蛋白质相互作用，直接影响信号传导、细胞过程和疾病表型。circHIPK3结合DRP1增强线粒体分裂和ROS产生，诱导血管平滑肌细胞坏死性凋亡和动脉粥样硬化易损斑块形成；m⁵C修饰的circCCNL2结合FXR2，减少游离FXR2-CDKL3相互作用，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖和肺动脉高压进展。circRNA还可作为蛋白质支架：circYap桥接TPM4和ACTG，减弱肌动蛋白聚合和心脏纤维化；作为蛋白质诱饵，circCacna1c隔离Hnrnpf在细胞质中，减弱RIPK1介导的坏死性凋亡并减少心肌梗死面积；作为招募器或适配器，circHelz通过NFATc2促进YAP核转位，促进心脏成纤维细胞增殖。

circRNA与pre-mRNA剪接的竞争是其另一重要功能。circRNA的生成通过反向剪接与常规线性剪接竞争，因此影响pre-mRNA剪接和成熟mRNA产生。circRNA生物合成的增加可能导致线性mRNA输出减少，潜在影响基因表达水平。

一些circRNA含有开放阅读框（ORF），可作为翻译模板。与经历帽依赖性翻译的传统mRNA不同，circRNA缺乏5′帽和3′poly(A)尾，主要通过内部核糖体进入位点（IRES）或m⁶A介导的起始进行翻译。m⁶A是哺乳动物mRNA中最常见的内部RNA修饰，已被证明可促进核糖体招募。一些内源性circRNA甚至可编码全长完整功能蛋白，如β-catenin。

工程化突破：从合成技术到治疗应用

circRNA生产依赖一系列环化技术。传统方法如置换内含子-外显子（PIE）系统利用I组自剪接内含子，但常留下残留的外显子衍生序列，可能引发免疫反应。核酶基方法使用嗜热四膜虫I组内含子实现无疤痕环化，体外和体内效率达80%。酶学策略包括使用T4 RNA连接酶产生均质circRNA，但在长前体转录本方面存在困难。混合方法如II组内含子介导的PIE和RtcB驱动的细胞内环化进一步扩展了无疤痕合成能力。

circRNA功能依赖于高效环化和结构完整性。虽然化学/酶学方法仅限于体外使用，但核酶适用于体外和体内应用。工程化m7G帽状circRNA（帽-circ mRNA）的核糖体招募效率比IRES依赖系统高50倍。与m7G帽状寡核苷酸杂交进一步增强了细胞类型选择性表达，通过使用m1Ψ修饰最大限度地减少免疫原性。

脂质纳米颗粒（LNP）是有前途的载体，因其结构稳定性和可控释放特性。固体脂质纳米颗粒、纳米结构脂质载体和阳离子脂质两亲物系统已广泛应用于癌症模型中的RNA递送。外泌体作为天然递送载体，具有高生物相容性和低免疫原性。通过表面修饰和货物加载优化，外泌体基系统已在脓毒症和多种癌症模型中用于circRNA递送。

circRNA疫苗技术近年来快速发展。circRNA疫苗设计除了优化结构稳定性、翻译效率和与靶分子的特异性相互作用外，解决免疫原性、安全性和对病毒变体的广谱保护至关重要。使用T4 RNA连接酶产生的circRNA免疫原性最低。进一步改进，如在侧翼末端加入非结构化元件以避免复杂二级结构，或添加可修饰的同源间隔子，可提高翻译效率和安全性。

若干研究探索了circRNA疫苗在治疗多种疾病方面的潜力。例如，工程化circRNA编码SARS-CoV-2受体，开发了circRNA-RBD-Delta疫苗以对抗COVID-19。研究发现circFAM53B非规范翻译隐藏抗原肽能够结合HLA-I并刺激初始CD4⁺和CD8⁺ T细胞，引发强烈的抗肿瘤免疫反应。

信号通路调控：心血管疾病的分子枢纽

circRNA通过精细调控多个关键信号通路在心血管病理生理中发挥核心作用。TGF-β信号通路是组织稳态和损伤修复的核心调节者，circRNA通过多种机制调控该通路。在心肌梗死中，circ-Ttc3通过隔离miR-15b-5p上调Arl2表达，减轻缺氧诱导的ATP耗竭和心肌细胞凋亡，间接减弱TGFβ1驱动的纤维化重塑。在心脏纤维化中，缺氧显著上调CFs中的CircHIPK3，通过吸附miR-152-3p激活TGF-β2轴，促进CF增殖、迁移和分化。在动脉粥样硬化中，circ_CHMP5通过吸附miR-516b-5p激活TGFβR2通路加剧内皮损伤，而circCOL1A通过吸附miR-30a-5p上调SMAD1抑制TGF-β信号。

Wnt/β-catenin信号通路调节基因表达和细胞稳态，circRNA通过调控该通路影响心血管疾病进程。在心肌梗死中，circNfix通过吸附miR-214上调Gsk3β并促进Ybx1泛素化，抑制心肌细胞增殖和血管生成；circARAP1通过调节miR-379-5p/KLF9轴激活Wnt/β-catenin通路，促进纤维化重塑；circNSD1作为miR-429-3p的海绵，上调硫酸酯酶1（SULF1）表达，随后激活Wnt/β-catenin信号级联。

PI3K/AKT/mTOR（PAM）通路是细胞存活、生长和代谢稳态的核心调节者，circRNA通过多种机制调控该通路。在动脉粥样硬化中，circZBTB46结合hnRNPA2B，稳定PTEN，从而抑制AKT/mTOR信号，抑制血管平滑肌细胞增殖和加剧斑块形成；circ_0040414通过吸附miR-186-5p上调PTEN，导致AKT抑制并通过抗炎信号促进心肌细胞存活。在血管生成方面，hsa_circ_0004543敲低通过激活PI3K/AKT/NOS3通路增强oxLDL诱导的内皮细胞增殖；circ_0002984通过吸附miR-181b-5p促进VEGFA上调，随后激活PI3K/AKT信号。值得注意的是，circ-Amotl1通过直接结合PDK1和AKT1，促进磷酸化AKT的核转位，减轻阿霉素诱导的心肌病，发挥心脏保护特性。

Hippo信号通路是进化保守的调控网络，circRNA通过调控该通路影响心血管疾病。在糖尿病心肌病中，circCDR1as通过抑制MST1泛素化激活Hippo通路，从而增强FOXO3转录活性和促进心肌细胞凋亡；在心肌缺血/再灌注损伤中，circ-ZNF609通过调节Hippo-YAP和Akt信号之间的串扰改善CM存活和增殖；在心肌梗死后，circHelz与YAP相互作用促进其核转位，这一效应受NFATc2调节，增强心脏成纤维细胞增殖。

NF-κB信号通路是心血管疾病中炎症、细胞存活和增殖的核心调节者，circRNA通过多种机制调控该通路。在动脉粥样硬化中，circ-Sirt1通过隔离miR-132/212上调SIRT1并减少NF-κB介导的转录，抑制新生内膜增生；circ_0026218通过吸附miR-188-3p抑制TLR4/NF-κB信号，维持血管稳态；circ-RELL1通过靶向miR-6873-3p下调MyD88，减轻内皮炎症。在急性心肌梗死中，circ_0060745敲低通过抑制NF-κB激活减少炎性细胞因子产生；circROBO2敲低通过重新激活miR-1184下调TRADD（TNF/NF-κB信号适配器），减少CM凋亡；circTLK1通过吸附miR-214上调RIPK1，增强TNF/NF-κB信号并促进CM凋亡。

挑战与展望：从基础研究到临床转化

尽管circRNA研究取得了显著进展，但将其转化为临床应用仍面临诸多挑战。机制理解方面的关键挑战在于解读circRNA功能的情境依赖性双重性理论，有些circRNA在不同CVD或同一疾病的不同阶段表现出相反的作用。这些相反的功能受时空因素如细胞类型、疾病阶段和微环境信号调控。未来研究应采用单细胞circRNA组学和空间转录组学来解析病理生态位内情境特异性circRNA相互作用组，促进条件激活型circRNA基治疗药物的合理设计。

技术限制方面，主要挑战之一是由于circRNA与线性mRNA序列重叠，准确检测circRNA存在困难。新一代测序（NGS），特别是长读长测序平台如Oxford Nanopore，通过解析反向剪接点（BSJ）促进了circRNA的识别。单分子荧光原位杂交（smFISH）技术采用针对BSJ的分裂探针设计，改善了固定组织中空间circRNA的可视化。然而，实时追踪活心肌细胞中的circRNA仍然难以实现。新型CRISPR基成像方法，如荧光标记的Cas13d变体，可能很快允许在心脏损伤和再生过程中动态可视化circRNA行为。

另一个关键前沿是靶向circRNA操作。传统的RNA干扰方法，如siRNA和shRNA，由于与线性转录本的外显子序列重叠而存在脱靶效应。在过表达方面，质粒基表达系统仍是标准，但新兴的体外环化方法使用置换内含子-外显子核酶，如Twister核酶介导的环化，现在允许可扩展生产合成circRNA。这些构建体需要 rigorous 验证，包括Sanger测序、RNase R抗性和 northern 印迹，以排除线性转录本的污染。

从机制上讲，大多数功能研究集中在ceRNA假说上，即circRNA作为miRNA海绵。然而，定量建模表明，由于拷贝数低，大多数circRNA对miRNA可用性的影响极小。除了海绵作用，circRNA-蛋白质相互作用已成为信号传导的关键调节者。先进方法如CLIP-seq和冷冻电子显微镜正被用于揭示这些相互作用。此外，人工智能驱动的预测模型在预测circRNA-蛋白质相互作用方面达到高精度，加速了机制洞察和靶点发现。

从临床角度看，circRNA转化为诊断和治疗面临两大障碍：生物标志物验证和治疗实施。虽然有希望的候选物如冠状动脉疾病中的circZNF609和动脉粥样硬化中的circ_0001900，但其临床效用受到几个固有挑战的限制。这些包括体液中丰度低、组织特异性高限制普适性，以及缺乏稳健、标准化的检测方案。CIRCULATE联盟最近提出了量化指南，倡导数字PCR（dPCR）和正交方法。进一步努力对于开发能够可靠量化临床样本中circRNA的高灵敏度和特异性检测方法至关重要。

在治疗方面，上海瑞金医院的临床试验正在研究HM2002，一种VEGF编码的circRNA，通过心肌注射方式用于接受冠状动脉旁路移植术（CABG）的缺血性心力衰竭患者（NCT06621576）。circRNA基疫苗的平行努力，如COVID-19候选疫苗，在灵长类动物中显示出比mRNA疫苗更高的中和滴度。

展望未来，空间转录组学与单细胞circRNA分析的整合将阐明心血管微环境中的circRNA定位。训练在这些数据集上的机器学习模型可以识别患者特异性circRNA靶点，实现精准治疗。合成生物学的进步，包括允许体内circRNA生成的tRNA基环化系统，以及先进的LNP和外泌体系统，可能克服合成和递送障碍。随着circRNA研究与基因编辑的融合，嵌入circRNA中的prime编辑指南可能为心肌细胞提供无疤痕基因组校正。虽然重大挑战依然存在，但高精度基因工具、可扩展生物制造和人工智能驱动靶点预测的协同作用，将推动circRNA在未来十年重塑心血管治疗领域。