综述：基于外泌体的骨质疏松骨再生治疗策略：挑战与潜在解决方案

本综述系统探讨了外泌体（exosomes）作为骨质疏松（OP）治疗新策略的潜力与挑战。文章详细阐述了外泌体在骨稳态调控中的核心作用，包括其来源（如MSCs、OBs、OCs、巨噬细胞等）、生物工程改造策略（如靶向肽修饰、RNA装载）及多重调控机制（如促进成骨分化、抑制破骨生成、免疫调节等），并指出其在克服传统疗法局限性（如副作用大、靶向性差）方面的独特优势。同时，综述也客观分析了当前面临的生物学挑战（如外泌体异质性、靶向特异性）和技术瓶颈（如分离标准化、规模化生产），为外泌体疗法的临床转化提供了全面而深入的见解。

　　

外泌体作为骨再生的天然递送系统

外泌体是直径30–150 nm、源于内体的细胞外囊泡，几乎由所有细胞类型分泌，富含蛋白质、脂质、RNA和DNA等生物活性分子，作为细胞间信使调控多种生物过程。其脂质双层膜可保护内容物免遭酶降解，即便在骨吸收部位的酸性环境中也能稳定递送生物活性分子。外泌体的组成取决于细胞来源和释放时的生理条件，例如间充质干细胞（MSCs）来源的外泌体富含生长因子、细胞因子和成骨miRNAs，可直接增强骨形成和成骨分化。

外泌体疗法的优势

与传统骨质疏松治疗相比，外泌体疗法具有显著优势：

• 高效性：外泌体（尤其是MSCs来源的）具有固有的归巢能力，可精准抵达骨重塑部位，提高疗效并降低剂量需求。

• 副作用小：传统抗吸收剂（如双膦酸盐BPs、地诺单抗）和合成代谢剂（如特立帕肽）常引起脱靶效应和系统毒性，而外泌体因其高生物相容性和低免疫原性，可长期使用且风险较低。

• 个性化潜力：外泌体可被工程化改造，以递送特定的成骨分子或miRNAs，满足不同患者的骨再生需求，并可修饰以精准靶向特定细胞类型，提升治疗精确度和有效性。

不同细胞来源的外泌体在骨再生中的作用与机制

间充质干细胞来源的外泌体

MSCs通过分化为成骨细胞（OBs）和分泌支持骨修复与重塑的生物活性因子来驱动骨再生。但有限的细胞存活率和免疫排斥问题使注意力转向MSCs来源的外泌体。它们通过向靶细胞递送成骨诱导因子来促进成骨作用。与外泌体相比，外泌体更稳定、免疫原性更低且无不受控的增殖，使其成为骨再生治疗的有前途的替代方案。研究表明，MSCs来源的外泌体调节成骨基因表达并增强分化。例如，骨髓基质细胞（BMSCs）来源的外泌体递送成骨miRNAs（如miR-196a）至OBs，促进体内骨形成。同样，牙髓干细胞（DPSCs）来源的外泌体与支架结合显著增强大鼠颅骨缺损的骨再生。成骨诱导的MSCs来源的外泌体因富含骨相关蛋白（如WNT5A、NOTCH2、BMP2、SPP1、BSP、BGLAP）而表现出增强的成骨潜力，这些蛋白促进了OB分化和钙沉积。这些发现表明，MSCs来源的外泌体作为有效的旁分泌调节剂，向OBs转移成骨诱导miRNAs和骨相关蛋白，从而重编程其基因表达并激活关键信号通路以加速分化和骨再生。

MSCs来源的外泌体也是血管生成的关键介质，这是有效骨再生的关键过程。例如，来自牙龈MSCs的外泌体富含成骨相关基因和蛋白（如ALP、OCN和RUNX2），增强了骨髓MSCs的成骨作用和内皮细胞的血管生成，从而促进体内骨形成和血管化。此外，MSCs来源的外泌体调节破骨细胞（OC）活性。来自循环机械拉伸处理的BMSCs的外泌体通过抑制NF-κB信号通路（特别是通过抑制IκBα降解、减少IκBα、IKKα/β和p65的磷酸化并阻止p65核转位）来抑制破骨细胞生成，从而减弱破骨细胞生成相关基因的表达，进而提高废用性骨质疏松（OP）小鼠模型的骨密度。BMSCs来源的外泌体通过TRIM25介导的TREM1泛素化促进M2巨噬细胞极化，增强成骨分化并减轻骨质疏松。类似地，富含miR-29a的MSC-EVs通过靶向VASH-1调节血管生成，而成骨性MSC-EVs携带关键蛋白如WNT5A、WNT5B、TGFB1、NOTCH2和JAG1以及成骨标志物如SPP1、BSP和BGLAP，驱动骨再生。总之，MSCs来源的外泌体通过同时促进成骨、血管生成、免疫调节和抑制破骨细胞活性来协调骨再生，通过协同递送成骨蛋白、调控miRNAs和信号调节剂来重编程骨微环境中的多个细胞靶标。

成骨细胞来源的外泌体

成骨细胞（OBs）来源的外泌体是骨再生的关键介质，促进骨稳态和修复所必需的细胞间通讯。这些纳米级、膜结合囊泡调节骨微环境，促进成骨分化，并增强损伤部位间充质干细胞（MSCs）的招募和增殖。OBs来源的外泌体递送成骨诱导因子，如蛋白质（BMP-9、OPG、EIF-2）和microRNAs（miRNAs）（如miR-30d-5p、miR-135B、miR-677-3p），这些对成骨作用至关重要。它们还通过miR-503-3p/Hpse轴抑制破骨细胞（OC）形成，从而防止过度骨吸收。尽管OB移植显示出最强的再生效果，但基于外泌体的治疗也增强了骨量和骨小梁结构，特别是在脊柱椎体。这些发现将OBs来源的外泌体定位为骨修复的有前途候选者，以及增强骨再生和治疗各种骨相关疾病的新策略。

破骨细胞来源的外泌体

破骨细胞（OCs）来源的外泌体是骨重塑的关键调节剂，促进骨微环境内的细胞间通讯。这些外泌体通过向成骨细胞（OBs）和骨细胞递送生物活性分子来影响成骨和骨吸收，突显了它们在骨再生治疗中的潜力。最近的一项研究鉴定出富含miR-106a-5p的OC-外泌体是成骨分化的关键调节剂，通过抑制Fam134a和上调成骨标志物（如Alp、Sp7、Col1a1和Runx2）促进小鼠颅骨缺损模型的骨再生。此外，炎症性OCs来源的外泌体通过ephrinA2/EphA2信号递送lncRNA LIOCE至OBs，稳定Osterix并增强OB活性。该机制在骨溶解和股骨缺损的体内模型中增加了骨量并降低了骨孔隙率。也有报道称，经淫羊藿苷（Icariin）处理的破骨细胞来源的外泌体（ICA-OC-Exos）通过增加OB ALP和OCN表达同时下调FGF23水平，显著增强OB活性和感染性骨不连模型的骨修复。类似地，破骨细胞小细胞外囊泡（OC-sEVs）高度富集miR-106a-5p，其抑制Fam134a并显著增强BMSCs的成骨矿化，最终促进颅骨缺损模型的骨再生。这表明MSCs和OCs来源的外泌体通过协同递送成骨蛋白、调控miRNAs和信号调节剂来增强OB活性、刺激血管生成、重编程免疫反应和抑制骨微环境中的抑制通路，从而协同驱动骨再生。

骨细胞来源的外泌体

骨细胞，嵌入在骨基质中，是骨稳态的核心调节剂，通过与成骨细胞（OBs）和破骨细胞（OCs）的通讯来协调骨重塑。它们释放外泌体以介导这种相互作用。在流体剪切应力下产生的机械刺激骨细胞来源的细胞外囊泡（MA-EVs）被发现显著促进人间充质干细胞（hMSCs）的招募和成骨分化，从而支持骨再生。蛋白质组学分析显示，这些MA-EVs富含 annexin A5 和组蛋白 H4 等蛋白，这些蛋白上调了成骨基因（COX2、OCN、OPN、RUNX2、OSX）并增强了碱性磷酸酶活性，揭示了一种新型的骨细胞介导的机械信号机制，用于无细胞骨再生治疗。类似地，对年轻骨细胞来源的EVs（YO-EVs）的研究突出了它们通过增加基质刚度（通过F-肌动蛋白聚合）和激活成骨基因（如RUNX2）来促进成骨作用，从而对抗年龄相关性骨丢失的潜力。相比之下，衰老骨细胞来源的EVs（SO-EVs）促进 adipogenesis，突显了年龄相关变化对EV功能的影响。此外，一项关于机械刺激骨细胞的研究报告称，它们的外泌体通过递送关键信号分子（如RANKL）来调节OB和OC活性，强调了它们在维持骨形成和吸收平衡中的作用。此外，在3D培养的MLO-Y4骨细胞中，流体剪切应力显著上调了焦磷酸转运蛋白Ank，而抑制Ank（通过丙磺舒）显著抑制了机械外泌体的产生，这一效应可通过外源性焦磷酸盐来挽救。此外，在机械负荷下，骨细胞来源的外泌体富含miR-23b-3p，靶向软骨细胞中的OTUD4，抑制线粒体自噬并使代谢偏向分解代谢，从而破坏软骨稳态。因此，骨细胞来源的外泌体作为机械响应调节剂，将流体剪切应力和年龄相关变化转化为分子信号（如annexin A5、组蛋白H4、RANKL和miR-23b-3p），直接调节OB和OC活性，驱动hMSCs成骨，并改变软骨细胞代谢，从而在情境依赖的方式下协调骨再生和退化。

巨噬细胞来源的外泌体

巨噬细胞通过极化为促炎（M1）或抗炎（M2）状态来调节骨再生，调控炎症、组织重塑和修复。它们的外泌体促进与成骨细胞（OBs）、破骨细胞（OCs）和BMSCs的通讯，影响骨稳态。来自M0和M2来源的巨噬细胞的外泌体促进骨形成，而M1来源的外泌体通过递送miR-155（下调成骨基因如BMP2、BMP9和RUNX2）来抑制骨形成。相反，富含miR-378a的M2外泌体通过上调成骨诱导基因来增强成骨作用。脉冲电磁场刺激将巨噬细胞转向M2表型，减少炎症并产生通过下调CTSK、NFATC1、TRAP、miR-7和miR-1897来抑制破骨细胞生成的外泌体。M2来源的外泌体还通过下调CSF2和失活TNF-α信号来抑制RANKL诱导的OC分化，CSF2敲低或TNF-α抑制增强了这种效应。此外，来自M1和M2巨噬细胞的外泌体促进BMSCs的成骨分化，其中M1来源的外泌体通过miR-21a-5p（上调标志物如ALP、BMP-2、OPN、OCN和RUNX2）主导早期炎症阶段。负载M2巨噬细胞来源外泌体的仿生骨膜构建物激活Rap1/PI3K/AKT信号通路并增强VEGF分泌，促进早期骨缺损中的BMSC招募、血管生成和成骨分化。在股骨头坏死临床前模型中，富含miR-93-5p的M2-Exos降低TGF-β和PTEN表达，同时上调VEGFA和Akt，从而改善内皮功能和血管-免疫串扰以支持骨修复。因此，巨噬细胞来源的外泌体具体介导骨再生，通过从M1外泌体递送抑制性miR-155来抑制早期炎症期间的BMP2/9和RUNX2驱动的成骨作用，而富含miR-378a、miR-93-5p和成骨诱导蛋白的M2外泌体激活Rap1/PI3K/AKT和VEGF信号，抑制RANKL/TNF-α诱导的破骨细胞生成，并增强BMSC招募、血管生成和成骨分化，从而协调从炎症消退到组织修复的过渡。

iPSC来源的外泌体

iPSC来源的外泌体因其多样的生物活性 cargo 和调节细胞功能的能力，在再生医学和治疗创新中成为有前途的候选者。iPSCs从体细胞重编程而来，可分化为多种细胞类型，其外泌体展现出这种多能性。这些囊泡携带非编码RNA，包括miRNAs和长链非编码RNA（lncRNAs），使它们能够影响靶细胞并改变病理过程。iPSC来源的外泌体在多种疾病中展示出治疗潜力，包括心血管、神经退行性和肌肉骨骼疾病，通过促进组织修复、调节免疫和减少炎症。在骨再生中，来自人iPSC来源的间充质干细胞（hiPSC-MSC-Exos）的外泌体通过上调RUNX-2、COL1、ALP、OPN和OCN的蛋白水平增强成骨分化，并在去卵巢大鼠模型中显示治疗骨质疏松性骨缺损的潜力。此外，在缺氧条件下培养的人iPSC来源的内皮细胞衍生的生物启发纳米囊泡（BNVs）富含CXCR4和miR-1246，被证明可重编程骨髓内皮细胞（BMECs）。这种重编程将其分泌谱转向增加VEGF、PDGFA、PDGFB、IL-10、TGF-β1、TGF-β2和PGE2的产生，这些共同促进成骨、抑制 adipogenesis 并支持M2巨噬细胞极化，突出了BNVs在OP治疗中的治疗潜力。此外，iPSC来源的外泌体通过激活PI3K/Akt信号通路增强血管生成，防止股骨头坏死中的骨退化。总之，iPSC来源的外泌体通过递送成骨诱导 cargo（RUNX2、COL1、ALP、OPN、OCN）来促进骨再生，这些 cargo 增强成骨分化，通过CXCR4/miR-1246重编程BMECs以增强VEGF、PDGF、IL-10和TGF-β分泌，用于血管生成和M2极化，并激活PI3K/Akt信号以抑制 adipogenesis 和防止骨退化，从而将成骨、血管化和免疫调节整合为一个统一的再生机制。

将骨再生转化为骨质疏松治疗：外泌体作为潜在治疗剂

当前知识差距

将骨再生策略转化为骨质疏松（OP）治疗仍然具有挑战性，因为疾病机制存在根本差异。骨再生侧重于激活成骨细胞（OBs）以形成新骨，而OP则以过度的破骨细胞（OCs）活性、OB功能受损和骨重塑 disrupted 为特征。来自再生模型的外泌体可能无法完全解决这些不平衡，特别是考虑到OP中成骨能力的年龄相关下降和骨驻留细胞（如OBs和BMSCs）的反应性降低。这种差异强调了需要进行OP特异性研究，而不是直接从骨愈合研究中推断。

骨质疏松微环境为外泌体干预引入了额外的复杂性。诸如 altered 系统信号、减少的细胞间通讯和合并症（如糖尿病或心血管疾病）等因素可能影响外泌体分泌、生物活性 cargo 和治疗潜力。例如，在骨质疏松条件下，BMSCs释放的外泌体与健康骨相比具有修改的分子谱，减少成骨信号有时有利于 adipogenic 分化。这些变异突出了理解疾病特异性在外泌体生物学中的改变的重要性，以优化其OP的临床应用。

另一个重大挑战在于缺乏外泌体分离、表征和递送的标准化方案，这限制了研究的可重复性和可比性。尽管有前景的临床前数据，但尚无确保治疗性外泌体纯度、稳定性和靶向递送的最佳方法的共识。未来的策略应旨在为OP特异性目的设计外泌体，例如表面修饰用于OC靶向、加载成骨miRNAs或掺入骨归巢肽。解决这些挑战可以将基于外泌体的疗法建立为OP传统药物治疗的精确、微创且高度适应的替代方案。

骨质疏松中的潜在机制

OP的当前治疗主要涉及抗吸收或合成代谢药物；然而，它们的有效性通常受到副作用和随时间推移效力下降的限制。因此，外泌体作为OP治疗的新途径越来越受到关注。由于OP特异性外泌体应用的直接研究仍然有限，来自骨再生模型的发现为其潜在机制和治疗效用提供了宝贵的见解。

外泌体在OP中作用的主要机制之一是通过促进成骨和增强OB功能，这些功能常常因衰老、雌激素缺乏和炎症细胞因子而受损。例如，MSCs来源的外泌体是OB分化的有效诱导剂，由其丰富的成骨相关miRNAs（如miR-335、miR-214-3p和miR-26a）驱动。这些miRNAs上调关键的成骨转录因子，包括RUNX2、OPN、Osterix（SP7）和胶原蛋白类型I（COL1A1），从而刺激OB增殖和基质矿化。外泌体预处理的最新进展表明，MSCs的低氧预处理通过上调缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）增强了它们的成骨潜力，增加了促成骨外泌体的分泌。另一种有前途的方法是基因修饰外泌体生产细胞以过表达成骨转录因子如RUNX2或BMP-2，增强了它们刺激骨形成的能力。此外，研究探索了外泌体与生物活性支架的组合，将装载成骨因子的工程化外泌体纳入3D打印或水凝胶基递送系统，创建用于骨再生的持续释放平台。这些方法在临床前模型中增强了骨愈合，并显示出将外泌体疗法转化为临床OP治疗的强大潜力。

除了刺激成骨作用，外泌体还调节破骨细胞生成并防止过度骨吸收，这是OP的一个关键特征。OC，源于造血前体细胞，通过受体激活剂核因子κB配体（RANKL）信号激活，刺激它们的分化和吸收活性。研究表明，来自MSCs的外泌体携带miR-503，通过抑制OC活性减少骨吸收，而来自HUVECs的外泌体递送miR-21-5p，从而增强骨形成。另一种创新方法涉及用OC靶向肽（如D-天冬氨酸基序）设计外泌体，这些肽选择性结合羟基磷灰石（骨吸收区域）并递送抑制性 cargo 以抑制其吸收活性。

除了对OBs和OCs的直接效应外，外泌体还调节炎症微环境，这是OP发病机制中的一个关键因素。慢性低度炎症，特别是在绝经后OP中，与促炎细胞因子（如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β））水平升高有关，这些细胞因子促进骨吸收并抑制成骨。来自各种细胞来源的外泌体通过递送抗炎miRNAs（包括miR-146a和miR-21）表现出有效的免疫调节特性，这些miRNAs下调NF-κB信号并抑制OC激活细胞因子的产生。此外，BMSCs来源的外泌体促进M2抗炎巨噬细胞的极化，这些巨噬细胞分泌增强成骨分化和减少骨吸收的因子。此外，调节性T细胞（Treg）来源的外泌体调节免疫-成骨串扰，促进成骨祖细胞的分化并减少炎症性骨吸收。这些发现强调了外泌体作为成骨剂和OP治疗免疫治疗工具的潜力。

结合生物工程方法进一步增强了外泌体对OP的治疗潜力。最有前途的创新之一是开发混合外泌体，通过将天然外泌体与合成纳米颗粒融合以增强其稳定性、靶向效率和可控释放。这些混合囊泡可以用骨靶向配体（如阿仑膦酸盐或羟基磷灰石结合肽）功能化，确保在骨质疏松骨组织中选择性积累。另一个突破是使用刺激响应性外泌体递送系统，其中工程化外泌体被封装在水凝胶或聚合物载体中，这些载体响应骨质疏松骨病变中的pH变化或与骨重塑相关的酶活性而降解。这种方法实现了持续、局部的外泌体释放，最大化其治疗效果同时最小化脱靶相互作用。

总之，尽管基于外泌体的OP治疗研究仍处于早期阶段，但来自骨再生模型的证据突出了它们靶向OP underlying 多方面机制的强大潜力。通过促进成骨、抑制破骨细胞生成和调节炎症，外泌体代表了传统OP治疗的有前途的替代方案。

骨质疏松亚型特异性考虑用于外泌体治疗

绝经后骨质疏松（PMOP）由突然的雌激素缺乏驱动，放大RANKL介导的破骨细胞生成和炎症信号。相比之下，老年性骨质疏松（SOP）反映了一个老化的骨环境，其特征在于干细胞衰竭、骨细胞/OB衰老、氧化应激和低度炎症，共同损害骨形成和质量。这些病理生理学差异意味着不同的治疗优先事项：抗吸收、免疫调节外泌体 cargo 与PMOP最相关，而SOP需要 rejuvenation 导向、促成骨/血管生成和抗衰老 cargo。

临床前证据支持这些亚型特异性考虑。在OVX啮齿动物（PMOP类似物）中，内皮细胞来源的外泌体（EC-Exos）减少了破骨细胞活性并保护了骨，其中miR-155被鉴定为关键的抗吸收 cargo，与雌激素戒断生物学一致。相比之下，SOP聚焦的研究通常使用自然老化模型或比较年轻与年长供体外泌体。年轻血浆来源的外泌体 consistently 增强成骨并减少吸收，在几个终点上优于年老外泌体。类似地，来自年轻供体的血清/血浆外泌体在年老啮齿动物中恢复了成骨潜力并改善了骨丢失，强调了SOP特定的 rejuvenation 机制。

机制性见解进一步强化了这些亚型区别。对于PMOP，NF-κB/RANKL信号和破骨细胞生成的下调（例如，通过来自EC-Exos的miR-155 cargo）是最有益的，而在SOP中，重点在于对抗细胞衰老/氧化应激和促进成骨细胞生成和血管生成。关于骨老化和EV生物学的评论强调，EV生物发生和 cargo 组成随着年龄不利地变化，表明年轻来源或工程化EVs在SOP中可能更有效。

从转化角度来看，循环外泌体谱 already 区分骨质疏松绝经后妇女与骨量减少或健康对照，支持在PMOP中外泌体 based 分层，其中炎症和吸收轴主导。PMOP可能特别受益于骨靶向外泌体，这些外泌体将抗吸收 payloads 集中在骨小梁表面（例如，酸性天冬氨酸富集（DSS）₆配体或工程化带有（DSS）₆和成骨合成代谢 cargos 的凋亡外泌体）。对于SOP，通过年轻来源外泌体、预处理或工程化增强 cargo 质量的策略以及实现骨细胞定向递送的方法尤其相关， given 骨细胞衰老的核心作用。因此，基于外泌体的OP治疗必须是亚型定制的：在PMOP中，内皮外泌体衍生的miR-155和其他抗吸收 cargos 抑制NF-κB/RANKL驱动的破骨细胞生成，解决雌激素戒断诱导的骨丢失，而在SOP中，年轻来源或工程化外泌体富含促成骨、血管生成和抗衰老因子，恢复OB功能，对抗氧化应激，并 rejuvenate 骨细胞，从而直接靶向 aging 相关的骨形成和质量下降。

靶向治疗和可控释放的潜力

在OP治疗中使用外泌体的一个关键优势是它们能够被工程化以实现向特定组织的靶向递送。在OP中，将治疗剂 specifically 导向骨组织可以通过在作用部位浓缩生物活性分子来显著增强疗效。

外泌体工程的最新进展使得能够修改表面蛋白质以促进与骨组织或骨吸收细胞（如OCs）的特异性结合。例如，掺入骨靶向肽，如那些结合羟基磷灰石或OCs上表达的整合素的肽，可以增强外泌体在骨质疏松骨中的积累，从而改善其治疗 cargo 的局部递送。这种靶向递送方法可能增加基于外泌体的疗法的疗效，同时减少潜在的脱靶效应。

用于OP治疗的工程化外泌体的最新进展包括开发与骨靶向肽（Asp-Ser-Ser）₆ [DSS₆]通过点击化学结合的牛奶来源的外泌体。这些外泌体装载了SIRT1激动剂SRT2104和用于MRI可视化的MnB纳米颗粒，有效促进成骨并抑制破骨细胞生成。在使用卵巢切除小鼠的体内研究中，显示骨矿物质密度增加、更高的小梁体积（BV/TV）和骨部位更强的荧光信号， confirming 这些工程化外泌体的骨靶向 efficacy 作为OP治疗和监测的有前途的诊疗平台。此外，一种治疗糖尿病OP（DO）的新方法利用装载到金包覆磁性纳米颗粒（GMNPs）上的BMSCs来源的外泌体来递送miR-150-5p。该递送系统通过激活Wnt/β-catenin信号通路和上调成骨标志物增强成骨，导致糖尿病大鼠模型中OB增殖和成熟改善。与这些发现一致，表3总结了不同外泌体来源及其对骨修复的贡献。

总之，这些策略强调，基于外泌体的OP治疗的成功转化将取决于将生物学洞察与工程创新、严格标准化和临床验证相结合。通过协调的跨学科努力，基于外泌体的干预措施有潜力不仅补充而且重新定义当前的OP管理，通过提供持久、靶向和疾病修饰的疗法。