非酿酒酵母调控石榴酒香气特征：基于GC-IMS、GC-MS与多元统计分析的深度解析

本研究针对石榴酒香气单一、感官品质受限的问题，系统探讨了非酿酒酵母（非Saccharomyces）纯种及顺序接种发酵（与Saccharomyces cerevisiae协同）对石榴酒挥发性风味物质的影响。研究采用GC-IMS和GC-MS技术结合多元统计分析，发现Torulaspora delbrueckii与S. cerevisiae顺序发酵（Td-Sc）可显著提升酯类物质含量和花果香气强度，感官评价最优，为石榴酒风味品质提升提供了有效的微生物调控策略。

　　

石榴（Punica granatum）是一种营养丰富且具有重要经济价值的水果，但其鲜果贮藏稳定性差，采后损失率高。将石榴加工成石榴酒等增值产品，不仅能延长货架期、减少浪费，还能提高经济效益。全球石榴市场增长迅速，预计到2034年将达到131.1亿美元。在此背景下，石榴酒作为新兴的非葡萄果酒，不仅具有独特的感官品质，还是一种潜在的功能性饮料，具有提升石榴经济与营养价值的双重潜力。

然而，与葡萄酒相比，石榴酒的研究相对较少，且面临诸多技术挑战，包括酵母多样性有限、香气轮廓相对简单以及感官接受度欠佳。目前，商业化生产主要依赖酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），但单一酵母的使用限制了挥发性化合物的多样性，制约了香气的复杂性。为了突破这些限制，非酿酒酵母（非Saccharomyces）已成为果酒发酵中有前景的替代方案。其中，顺序接种发酵（即先接种非酿酒酵母，再接种S. cerevisiae）已被证明能够增强葡萄及其他果酒的挥发性复杂度和感官品质。在非酿酒酵母中，Torulaspora delbrueckii因其强大的发酵能力、酯类生产能力以及在顺序发酵中的良好兼容性而受到广泛关注。另一种酵母Torulaspora quercuum虽研究较少，但在苹果酒等果酒的先前试验中已显示出有前景的发酵特性。

本研究旨在探究S. cerevisiae、T. delbrueckii和T. quercuum在纯种及顺序发酵中对石榴酒挥发性成分的影响。研究采用气相色谱-离子迁移谱（GC-IMS）和气相色谱-质谱联用（GC-MS）两种技术，结合偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、偏最小二乘回归（PLSR）、气味活性值（OAV）计算及感官评价，系统解析接种策略如何调控香气轮廓与感官感知，为利用Torulaspora酵母作为发酵剂以提升石榴酒香气复杂度及消费者吸引力提供新的见解。该论文发表在《Journal of Agriculture and Food Research》上。

为开展研究，作者主要应用了以下关键技术方法：采用Torulaspora quercuum X24-4和Torulaspora delbrueckii X28-10（实验室从苹果皮分离保存）与Saccharomyces cerevisiae WLS21进行纯种及顺序发酵；利用GC-IMS和GC-MS对挥发性化合物进行定性与定量分析；通过PLS-DA和PLSR等多变量统计方法识别关键差异化合物并建立香气属性与感官评价的关联；计算OAV评估化合物对整体香气的贡献；并由经过培训的感官评价小组（15人）对酒样进行描述性分析。

3.1. 酵母的生长动力学

酵母的生长动态与持久性直接影响石榴酒的最终风味。在纯培养中，S. cerevisiae生长迅速，第4天达到峰值；T. quercuum在前6天保持稳定，第7天开始减少；而T. delbrueckii表现出渐进式生长，第8天达到峰值并保持稳定，其生物量甚至高于S. cerevisiae，显示出在石榴汁基质中的优异适应性。在顺序发酵中，S. cerevisiae的生长未受T. quercuum显著影响，但T. quercuum的细胞数量在后期下降，可能源于营养竞争或乙醇积累等间接压力。与T. delbrueckii共发酵时，S. cerevisiae活力变化不大，但T. delbrueckii种群从第4天起略有下降，表明两种酵母间的代谢相互作用限制了后者的生长。

3.2. 石榴酒的理化参数

不同发酵策略获得的石榴酒在可溶性固形物（SSC）、乙醇含量、pH、总酸和总酚等方面存在差异。纯T. quercuum发酵样品（Tq）的SSC最高，乙醇含量最低（仅0.20%）。T. delbrueckii纯发酵（Td）显示出显著的发酵能力，但乙醇产量（5.40%）低于S. cerevisiae纯发酵（Sc，6.68%）。顺序发酵样品（Tq-Sc和Td-Sc）的乙醇含量与Sc无显著差异， reaffirming S. cerevisiae的强大产乙醇能力。发酵后酒样pH显著降低，总酸升高，表明酸性化合物产量增加。总酚含量在发酵后普遍下降，可能与多酚的水解、氧化以及被酵母细胞壁吸附等有关。

3.3. GC-IMS鉴定的石榴酒挥发性成分谱

通过GC-IMS分析，在最终石榴酒中共鉴定出62种化合物（其中3种为二聚体），包括20种酯、9种醇、9种醛、7种酮、4种酸和13种其他化合物。指纹图谱分析显示，顺序发酵样品的挥发性化合物谱具有较高的相似性。发酵过程中，醇类和酯类（如苯乙酯、异戊酸乙酯和3-甲基-1-丁醇）的产量显著增强。与T. quercuum和T. delbrueckii纯发酵相比，S. cerevisiae在发酵过程中产生的化合物显著更多。在顺序发酵中，酵母菌株间的相互作用导致了更为多样的挥发性化合物谱。Td-Sc样品中3-甲基-1-丁醇、异戊酸乙酯和（Z）-3-己烯丙酯的含量尤为突出。

3.4. GC-MS分析石榴酒中的挥发性成分谱

GC-MS共鉴定出80种化合物，包括29种酯、15种醇、11种醛和酮、4种酸、15种萜烯和6种其他化合物。Td-Sc样品表现出最高数量和总浓度的挥发性化合物，而Tq样品的挥发物多样性和浓度相对有限。酯类是形成果香和花香的关键。乙酸乙酯、苯乙酯、辛酸乙酯（在Td-Sc中含量最高，达19318.44 μg/L）、癸酸乙酯和己酸乙酯等均在石榴酒中检测到较高浓度，尤其在Td-Sc样品中。高级醇在低于300 mg/L时能赋予酒愉悦的花果香气。Tq-Sc样品的高级醇总浓度最高（13.0 mg/L），远低于阈值。苯乙醇（玫瑰香气）、1-己醇（果香和青草香）等是主要的醇类物质。酸、醛酮和萜烯类化合物也对酒的风味轮廓有重要贡献，但其总体浓度较低，避免了负面风味的产生。

3.4.2. 挥发性化合物的OAV计算

OAV分析用于评估化合物对香气的贡献。共有19种挥发性化合物的OAV大于1，被认为是关键香气物质。酯类化合物对酒的花果香气形成至关重要。苯乙酯（OAV最高2.23）、2-甲基丁酯（香蕉香，OAV=1.14）、异戊酯（香蕉香，OAV=1.32）等乙酸酯，以及辛酸乙酯（OAV高达9659.22，浓郁花香）、9-癸烯酸乙酯（OAV=11.79，柑橘香）、癸酸乙酯（OAV=27.46，葡萄香）和己酸乙酯（OAV=270.67，果香）均是重要的贡献者。

3.4.3. 基于PLS-DA模型的石榴酒挥发性成分差异分析

PLS-DA模型有效区分了不同发酵策略的样品，总方差解释率为87.3%。Sc和Tq-Sc之间的差异较小，而Td和Sc的顺序发酵与其他石榴酒存在显著差异。整合GC-IMS和GC-MS的分析结果，3-甲基-1-丁醇和己酸乙酯被确定为重要的差异化合物。尽管3-甲基-1-丁醇的OAV<1，但它可能通过与其他挥发物的协同作用增强花果香复杂性。己酸乙酯在所有样品中OAV>1（在Td-Sc中高达270.67），贡献苹果皮、白兰地和菠萝般的果香。

3.5. 感官分析

感官评价确定了石榴酒的8种香气属性：果香、花香、甜香、蜂蜜香、坚果香、木香、酒香和烘烤香。雷达图显示，发酵石榴酒以丰富的果香、花香、甜香和明显的酒香为特征。Td、Sc和Tq-Sc样品具有相似的花果香气，而Td-Sc样品的香气最为浓郁，这可能与更高浓度的酯类（如癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、辛酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯）和其他挥发物（如苯乙醇、壬醛）有关。Tq样品的总体评分较低。PLSR分析进一步表明，乙酸酯和醇类对花香属性的贡献最为显著。

本研究通过综合运用现代分析技术与多元统计方法，系统阐明了非酿酒酵母顺序接种发酵对石榴酒香气特征的调控作用。研究结果表明，采用Torulaspora delbrueckii与Saccharomyces cerevisiae进行顺序发酵（Td-Sc）能有效提升石榴酒中酯类物质的合成，特别是辛酸乙酯、己酸乙酯等高OAV值的化合物，从而显著增强其花果香气强度，获得最优的感官评价结果。这不仅证实了非酿酒酵母在提升果酒风味品质方面的巨大潜力，也为开发香气浓郁、特色鲜明的石榴酒产品提供了可靠的微生物策略与理论依据。未来研究可进一步深入解析混合培养发酵中酵母相互作用的机制，并探索更多本土非酿酒酵母菌株的应用，以全面优化石榴酒的品质属性。