范可尼贫血通路中SXE核酸酶复合物修复酒精诱导DNA交联的分子机制解析

本期推荐一项关于酒精代谢物导致DNA损伤修复的重要研究。为解决酒精衍生的乙醛DNA交联(AA-ICL)修复机制问题，研究人员开展SIx4-Xpf-Ercc1(SXE)核酸酶复合物作用机制研究，发现SXE通过双侧精确切割实现AA-ICL解钩，并能处理Ap-ICL等多种交联类型，揭示了FA通路作为通用DNA交联修复机制的重要意义。

　　

当酒精在人体内代谢时，会产生一种名为乙醛的有毒化学物质，这种物质能够与DNA发生反应形成链间交联(AA-ICL)。这些交联结构会阻碍DNA复制进程，威胁基因组稳定性。一种罕见的遗传性疾病——范可尼贫血(FA)——患者表现出对包括乙醛在内的DNA交联剂的极端敏感性。虽然已知范可尼贫血DNA修复通路能够修复这类损伤，但具体如何修复乙醛交联的分子机制至今未明。

这项发表在《Communications Biology》的研究由捷克科学院的Jana Havlikova等学者完成，他们发现FA核酸酶Slx4-Xpf-Ercc1(SXE)在AA-ICL修复中起关键作用。通过使用带有位点特异性AA-ICL的DNA复制叉结构，研究人员证明SXE能够特异性切除这种交联，揭示了其在酒精诱导DNA链间交联修复中的作用。更重要的是，SXE能够在AA-ICL两侧进行两次精确切割，并能以类似方式修复碱性位点交联，表明SXE是一个多功能核酸酶复合物。

研究采用的主要技术方法包括：位点特异性酒精诱导乙醛交联(AA-ICL)的化学合成、Xpf-Ercc1核酸酶复合物的重组表达与纯化、变性PAGE凝胶电泳分析交联形成与稳定性、体外核酸酶活性测定实验体系，以及使用非洲爪蟾卵提取物进行的DNA修复实验验证。

Preparation of site-specific alcohol-induced interstrand crosslink

研究人员合成了与酒精诱导链间交联(AA-ICL)化学结构完全相同的合成交联物。通过在特定位点修饰有2-氟脱氧肌苷(2-F-dI)残基的合成单链DNA oligonucleotide，通过与(4R)-4-氨基戊烷-1,2-二醇通过SNAr反应偶联。该反应中，残基的C-2氟原子可被伯胺等亲核试剂取代，所得产物作为制备与DNA内鸟嘌呤与两个乙醛分子反应形成的相同损伤的起始材料。

Formation and stability of AA-ICL: the rate of formation of AA-ICL is relatively slow, but so is its degradation

研究发现AA-ICL的形成速率相对较慢，但其降解也同样缓慢。在不同含有天然相同损伤PdG的寡核苷酸中观察到DNA交联形成(图2A)。将寡核苷酸退火后，交联反应在黑暗中进行，通过15%变性PAGE凝胶分析反应速率约为每天0.1%。为了验证交联特异性发生在PdG与对侧dG之间，研究人员将dG替换为肌苷，发现只有在含有PdG与对侧dG的双链体中才形成交联，证实了C-2氨基基团的必要性。

纯化后的AA-ICL在37°C下降解，通过变性凝胶分析发现两种AA-ICL的半衰期分别为t_1/2 AA-ICL1=2.12±0.05天和t_1/2 AA-ICL3=2.88±0.05天。降解同样是一个相对缓慢的过程，且反应未达到完全转化，表明交联与非交联DNA之间形成平衡状态。

Nuclease complex SXE unhooks alcohol-derived DNA inter-strand crosslink

为阐明FA核酸酶复合物SXE修复AA-ICL的分子机制，研究人员使用仅在AA-ICL和荧光探针位置不同的非交联和交联DNA叉状结构。这些底物在叉状结构的左侧5'或3'端进行荧光标记以追踪切割事件。酶促反应通过15%变性PAGE凝胶分析解析。

荧光标记底部链使得能够可视化对应此DNA链的切割。在非交联和交联底物的定性反应比较产物显示(图3B，C)，并配有相应的定量反应(图3D)。在所有交联底物制备中观察到一个持久的35-nt条带，可能代表由Schiff碱连接部分逆转产生的单链DNA片段。其在反应时间过程中的恒定强度表明其不受SXE活性影响。

对于非交联底物，检测到两个不同的产物，15 nt和19 nt大小，分别指定为P1和P2切口，证实了底部链上的位点特异性切口。在交联底物(AA-ICL1)中观察到类似的切割模式，其中检测到对应15 nt大小的P1切口，但第二个切口产物P2比对应ssDNA的35 nt对照迁移更高(图3B，D)。这种改变的迁移与一个片段通过共价交联连接到未标记臂的情况一致。这些结果表明，即使存在交联，两个SXE切口也发生在DNA叉状结构上。

SXE assays with AA-ICL on DNA substrate labelled on the top strand confirm dual incisions flanking the crosslink

使用在顶部链荧光标记的叉状结构进一步测试切割模式。使用带有5'端探针的非交联DNA叉状结构的反应未显示SXE复合物在标记链上的任何可检测活性(图4B)。然而，由于标记设置，切开的链在变性凝胶分析中不可见。

相比之下，AA-ICL3的切割产生两个不同的产物P1和P2，两者迁移分子量均高于整个DNA叉状结构臂的35 nt非交联对照(图4B，C)。这一结果表明DNA交联(AA-ICL3)在底部链被切除，因为非交联对照在反应中保持不变，且最终产物迁移大小大于35 nt对照。第一个指示为P1的切口是迁移较高的条带，而P2可能从交联的另一侧切割，对应第二个切口。然而，这些反应未确定切口的顺序。

对3'端标记底物(AA-ICL4)的进一步研究证实了SXE的双切口。对于AA-ICL4检测到与AA-ICL3相同的对应P1和P2的条带模式，其中探针位于相反DNA末端，进一步证实了双切口(图4D)。然而，在3'端的额外切割产生了一个较小的产物PN，表明在dsDNA末端对含荧光团链的切口。随着时间的推移，随着切口继续，所有对应P1和P2的条带消失(图4E)，表明荧光标记被SXE从P1和P2产物中移除。与之前一样，只有顶部链标记的非交联DNA叉状结构未产生P1或P2切口，除了小的PN产物。

The kinetics of SXE cleavage of alcohol-derived acetaldehyde DNA interstrand crosslinks

对AA-ICL时间过程反应的凝胶进行量化，将切割数据对时间作图并拟合(图3E和4F)。对于顶部链的标记，特别是5'标记的AA-ICL3底物，切割速率确定为k=0.10±0.02 min^-1，而3'标记的AA-ICL4表现出更高的速率k=0.25±0.04 min^-1。这种差异表明荧光标记的位置影响SXE活性，可能是由于荧光团对叉状结构自由臂的空间位阻。对于底部链，特别是5'标记的AA-ICL1底物(图3E)，切割速率确定为k=0.12±0.03 min^-1。相比之下，非交联底物的切割速率为k=0.05±0.08 min^-1。值得注意的是，虽然交联(ICL1)和非交联(AA-Y1)叉状结构底物在可比较的位置被切割，但SXE复合物在交联底物上显示出适度更快的切口动力学，反应速率约高两倍(图3E)。

SXE excises the abasic site interstrand crosslinks(Ap-ICLs), a substrate of Neil3 glycosylase

SXE已被证明可切割AA-ICL(本研究)和氮芥ICL。为进一步研究SXE的底物范围，研究人员检测了其对碱性位点链间交联(Ap-ICL)的活性。Ap-ICL是在Ap位点的开环核糖醛基与对侧链相邻碱基(dT)的腺嘌呤(dA)发生交联时自发形成的(图5A)。尽管与AA-ICL类似，但Ap-ICL表现出根本性差异，包括其化学组成和结构方向。具体而言，Ap-ICL形成方向与AA-ICL相反。

在SXE核酸酶试验中，研究人员使用左侧DNA叉状结构底物评估了Y1、AA-ICL1和Ap-ICL1的切割，这些底物在底部链5'端带有荧光探针(图5B)。与AA-ICL的对照反应产生两个预期产物(P1和P2)，与先前结果一致(图3)。类似地，Ap-ICL底物产生P1和P2，类似于AA-ICL切割的产物。P1迁移显著高于叉状结构臂，而P2对应15-nt片段。这些结果证实Ap-ICL被解钩且不抑制SXE活性。尽管与AA-ICL相比交联方向存在差异，但SXE能有效切割Ap-ICL。这一发现证明SXE处理多种DNA交联，包括由自发碱性位点形成的交联。

Mouse Neil3 enzyme responsible for Ap-ICL repair does not cleave AA-ICL

由于Ap-ICL在FA通路启用前的上游步骤中由Neil3糖基化酶修复，且SXE能与其他ICL一致地处理Ap-ICL，研究人员研究了Neil3如何处理AA-ICL。他们使用了来自小鼠Neil3的催化NEI结构域，该结构域在复制耦合修复期间负责酶促移除Ap-ICL。在比较Ap-ICL与AA-ICL时，在与SXE酶促试验类似的反应条件下测试了AA-ICL和Ap-ICL对NEI结构域的酶促试验。选择底物(Ap-ICL2，AA-ICL1)以有利于Neil3糖基化酶活性，因为NEI结构域对Ap位点包含链3'端的单链DNA(ssDNA)表现出强烈偏好。

与SXE不同，NEI结构域未切除或逆转AA-ICL DNA叉状结构底物。然而，含Ap-ICL的叉状结构如预期被糖基化酶活性切割，作为内部对照验证了在这些试验条件下Neil3的活性(总结于表1)。

讨论与结论

酒精消费是多种癌症的主要风险因素，然而将酒精与基因组不稳定性联系起来的潜在分子机制仍知之甚少。乙醛作为酒精的有毒代谢物，与DNA反应并最终导致链间交联(AA-ICL)的形成，这些交联共价连接DNA双螺旋的两条链。这些损伤尤其成问题，因为它们在基因组中的持久性。其缓慢的水解降解使它们在较长时间内保持完整。如果不修复，AA-ICL可能阻断转录和复制等基本细胞过程。这种破坏导致DNA双链断裂、染色体不稳定，并最终导致肿瘤发生。

AA-ICL在酒精消费过程中产生的数量因酒精摄入量、乙醛解毒效率等因素而异，且强烈取决于PdG(丙烷脱氧鸟苷)的持久性，这是一种诱变加合物。尽管PdG前体的体外形成效率相对较低，构成主要乙醛加合物N2-亚乙基-dG的不到10%，但过量的乙醛暴露将PdG形成速率提高至约每24小时每1.3×10⁹ dG形成1个PdG分子。在二倍体人类基因组(1.23×10⁹ GC对)中，这导致每天形成约20个PdG分子。此外，组蛋白和多胺(包括亚精胺)等碱性分子的存在显著增强PdG形成，表明强烈的环境影响。

乙醛通常通过形成亚胺或Schiff碱与细胞内大分子结合，这些加合物与其未反应组分处于动态平衡，并在生理条件下易于水解。本研究证明了AA-ICL的形成和分解速率。分离的相对纯的AA-ICL缓慢分解，即使在14天后也未达到平衡，表明AA-ICL非常稳定，约30%的原始AA-ICL仍留在反应混合物中。尽管分离的AA-ICL分解产生少量百分比ssDNA，但ssDNA水平在整个反应过程中保持一致。这些稳定的背景信号可在分析过程中减去，以专注于酶活性和产物形成。时间过程实验证实，对应非交联链的条带保持稳定，使得能够准确减去并确保清晰关注酶促过程。

如先前对氮芥ICL所示，SXE复合物通过双切口切割ICL，在复制叉的一条链上围绕交联进行两次精确切割，与XE单独观察到的活性并无不同。研究表明Slx4显著增强SXE复合物的活性，特别是对叉状DNA结构，从而改变底物特异性。值得注意的是，SXE对交联与非交联底物没有显著偏好。

虽然FA通路和一种未知机制已涉及非洲爪蟾卵提取物中的AA-ICL修复，但精确的分子机制和负责的酶仍不清楚。本研究证明SXE通过在交联周围进行两个切口来解钩AA-ICL，特别是在包含3'-ssDNA臂的复制叉的底部链上。这证实了体外SXE能够以类似于氮芥DNA ICL的方式切割AA-ICL。

有趣的是，SXE介导的切口反应速率无论是否存在交联都保持一致，表明SXE主要识别叉状DNA结构而非ICL本身。研究人员推测，在体内条件下，其他因素如FA蛋白和复制叉的X结构可能影响SXE的特异性和效率。本研究中观察到的切口，在X结构背景下，将导致AA-ICL解钩和DNA链分离。这种分离将允许损伤链通过FA通路进行后续修复步骤，这一过程对于恢复复制、维持基因组稳定性和确保正常细胞功能至关重要。

本研究还表明SXE切割Ap-ICL，因此不是对交联特异性的，而是围绕损伤位点切割，无论ICL的性质或存在与否。此外，最近一项研究表明FA细胞对谷胱甘肽(GSH)耗竭高度敏感，因为GSH解毒小反应性醛类如甲醛并帮助缓解氧化应激。虽然GSH耗竭与Ap-ICL或醛诱导ICL形成之间的直接联系仍不清楚，但早期研究表明GSH耗竭与增加ICL形成之间存在关联。低GSH条件下的氧化损伤可能导致更多ICL，然后由SXE复合物修复。这种相关性可能有助于解释在GSH耗竭下FA缺陷细胞中观察到的增强敏感性和致死性。然而，在这些条件下ICL修复的具体贡献需要进一步研究。

Neil3是修复Ap-ICL的主要酶，研究人员发现SXE能够以类似于Ap-ICL的方式处理酒精衍生的AA-ICL和Ap-ICL，表明其作为多功能FA核酸酶的潜在作用。然而，需要进一步研究来确认其在细胞中AA-ICL修复的参与。SXE能够切割多种ICL，包括乙醛、碱性位点和氮芥诱导的ICL，表明FA修复通路成为一种能够处理各种类型ICL的通用机制。

这项研究的重要意义在于揭示了SXE核酸酶复合物作为酒精诱导DNA损伤修复的关键分子机器，为理解酒精相关癌症的发生机制提供了重要见解，也为范可尼贫血等遗传性疾病的治疗策略开发指明了新方向。