Starmerella bacillaris酵母衍生物在提升葡萄酒稳定性方面的应用：细胞壁组成与提取技术的影响

《Food Frontiers》：Starmerella bacillaris Yeast Derivatives for Improving Wine Stability: Effect of Cell Wall Composition and Extraction Techniques

葡萄酒中蛋白浑浊的稳定化研究及新型添加剂开发。通过对比星形霉球拟酵母（S. bacillaris）与酿酒酵母（S. cerevisiae）的细胞壁提取物，发现经碱处理的S. bacillaris提取物（含高葡萄糖和低分子量多糖）对蛋白浑浊抑制效果最佳，较传统方法提升稳定性17%-35%。研究揭示了提取工艺、多糖分子量分布及糖蛋白结构对稳定性的关键影响，为开发绿色酵母衍生物提供了理论依据。

　　酵母衍生物在葡萄酒酿造中的应用已有悠久的历史，其在控制蛋白质浑浊方面的潜力引起了广泛关注。传统上，葡萄酒中用于稳定蛋白质的物质主要是由Saccharomyces cerevisiae（酿酒酵母）提取的曼诺蛋白，这些物质能够显著减少由于蛋白质不稳定导致的浑浊现象。然而，近年来，非Saccharomyces酵母，尤其是Starmerella bacillaris（星霉酵母）因其独特的代谢和结构特征而逐渐成为新的研究热点。本研究探讨了从S. bacillaris细胞壁中提取的富含曼诺蛋白的衍生物作为新型稳定剂在葡萄酒中预防蛋白质浑浊的应用潜力。通过工业化的分批培养条件，获得了来自三种S. bacillaris和两种S. cerevisiae菌株的酵母细胞壁，随后采用热处理、酶解和碱性提取等方法进行提取，并对提取物的化学组成和其在白葡萄酒中的蛋白质稳定性进行了系统分析。研究发现，S. bacillaris的细胞壁提取物中葡萄糖含量显著高于S. cerevisiae提取物，同时蛋白质的大小分布也显示出显著差异。这些结果表明，S. bacillaris细胞壁中存在高分子量的（葡萄糖）曼诺蛋白。与S. cerevisiae相比，S. bacillaris的提取物在减少浑浊方面表现出更高的效果，特别是在碱性处理后。这些发现强调了酵母种类和提取策略对衍生物功能的重要性，并将S. bacillaris定位为一种有潜力的葡萄酒添加剂来源，用于蛋白质稳定。

酵母细胞壁（YCW）是一种复杂的动态结构，主要由碳水化合物组成，包括β-葡聚糖、甘露聚糖和几丁质。其中，曼诺蛋白是一类关键的酵母衍生物，它们是高度糖基化的蛋白质，主要由甘露糖组成，占其质量的高达90%。曼诺蛋白在细胞壁中不仅具有结构功能，还在葡萄酒加工中发挥着重要作用，特别是在减少蛋白质不稳定引发的浑浊方面。葡萄酒中的蛋白质通常处于一种亚稳态，当环境因素如pH值、温度和离子强度变化时，这些蛋白质可能会发生展开和聚集，导致可见的浑浊，从而影响葡萄酒的清澈度和商业价值。传统上，人们通过使用膨润土（bentonite）进行去蛋白处理，这是一种带负电荷的蒙脱石黏土，但这种方法存在一些局限性，如香气损失和废弃物处理问题。因此，曼诺蛋白在减少蛋白质浑浊方面的潜力为更可持续的葡萄酒酿造提供了一种有吸引力的替代方案。此前已有研究报道，与未处理的葡萄酒相比，使用曼诺蛋白可有效降低蛋白质相关浑浊。

为了获得曼诺蛋白，通常需要通过细胞破裂并结合化学或物理方法进行纯化。传统上，曼诺蛋白主要从S. cerevisiae中提取，但近年来，这些非Saccharomyces酵母因其技术潜力在葡萄酒酿造中的应用日益受到关注。最近的研究进一步探索了这些酵母在生产创新酵母衍生物方面的潜力，利用它们独特的生物学特性。在这些非Saccharomyces酵母中，S. bacillaris因其在葡萄上天然存在，且与S. cerevisiae在遗传上更远，表现出独特的代谢特征，如中心碳代谢的变化和对不同环境的适应能力。当用于顺序接种时，S. bacillaris已被证明比单独使用S. cerevisiae发酵时能提高葡萄酒的蛋白质稳定性。这种改善主要归因于在酒精发酵过程中释放出的低至中等分子量多糖，包括曼诺蛋白。这些发现提示了不同酵母种类在细胞壁重塑和代谢过程中存在不同的动态特征，但目前关于S. bacillaris细胞壁成分的结构和组成信息仍然有限，这在当前文献中是一个重要的空白。

本研究的目的是深入分析不同S. bacillaris细胞壁的多糖成分，并评估其作为稳定剂在防止葡萄酒蛋白质浑浊方面的潜力。为了实现这一目标，从三种S. bacillaris和两种S. cerevisiae菌株中获得了酵母衍生物，使用在工业分批条件下培养的生物量，并采用热、酶解和碱性提取方法进行处理。随后，对每种提取物的化学组成进行了测定，并评估了它们在白葡萄酒中稳定蛋白质的能力，强调了物种特异性属性和提取技术对效果的影响。

酵母的生长过程是研究中的关键部分。三种S. bacillaris菌株（PAS103、FRI7100和SFL1）和两种S. cerevisiae商业菌株（SELECTYS ITALICA BARCO和SOEC 1971）在分批条件下进行培养，这是一种在工业生产中广泛使用的技术，常用于生产活性干酵母。经过分批培养后，S. bacillaris的干生物量浓度平均为24.39 ± 1.34 g/L，而S. cerevisiae的干生物量浓度为40.64 ± 1.14 g/L。回归分析显示，分批培养过程在所需的特定生长速率（0.1 h?1）下成功进行。然而，两种酵母种类在糖到生物量的转化效率上存在显著差异，导致最终干生物量的产量不同。S. cerevisiae的转化效率为0.57 ± 0.01 g/g，而S. bacillaris的转化效率仅为0.30 ± 0.01 g/g。这种差异可能与S. bacillaris在糖发酵过程中将碳流重定向至甘油积累有关。甘油的积累可以作为维持细胞内NAD?水平的一种策略，特别是在发酵条件下，线粒体活动受限。此外，甘油还参与细胞的渗透调节，其产量会随着渗透压力的增加而上升。然而，在本研究中使用的培养基并不具有渗透压力，因此S. bacillaris在非渗透或非氧化压力环境下仍表现出甘油的构成性积累，这可能是其维持氧化还原平衡的一种机制。

S. bacillaris和S. cerevisiae的干酵母（DY）和细胞壁（YCW）成分也存在显著差异。DY中S. bacillaris的蛋白质和脂质含量明显高于S. cerevisiae，而碳水化合物含量则相对较低。相比之下，YCW的组成在两种酵母种类之间较为相似。这表明，S. bacillaris和S. cerevisiae在生物量中的主要差异可能与细胞质成分有关，而非细胞壁本身。然而，YCW的组成与文献中的典型数据存在差异，这可能与培养条件、培养基组成、氮源可用性和采收时间等因素有关。这些因素已知会影响细胞壁的组成，而本研究中使用的细胞壁是通过分批培养获得的，该培养过程在工业类呼吸条件下进行，这可能对细胞壁的结构产生重大影响。此外，细胞壁的制备过程并未包括去除细胞壁相关膜成分的纯化步骤，这可能也导致了报告的脂质和氮含量偏高。值得注意的是，一个类似的YCW组成已被报道用于工业生产的S. cerevisiae细胞壁产品，进一步支持了工业培养条件和分离方法对成分变化的影响。

为了获得富含曼诺蛋白的YCW衍生物，研究采用了三种提取方法：热水提取、酶解提取和碱性提取。热水提取通过加热YCW来释放可溶性大分子，而酶解提取则利用商业化的葡聚糖酶混合物来水解β-葡聚糖，从而促进细胞壁中嵌入的大分子的提取。碱性提取则通过使用碱性溶液溶解碱敏感成分，从而获得可溶性细胞壁提取物。本研究发现，S. bacillaris在碱性提取中表现出更显著的细胞壁降解和更高的可溶性大分子回收率，这表明碱性提取是工业生产富含多糖衍生物的一种特别有前景的方法，因为它提供了更高的产量和更高效的处理过程。

进一步的化学分析显示，S. bacillaris的YCW提取物中葡萄糖含量显著高于S. cerevisiae的提取物。这一发现表明，S. bacillaris的曼诺蛋白可能含有葡萄糖基团，而不仅仅是甘露糖。这与传统上认为的S. cerevisiae曼诺蛋白的高甘露糖含量不同，提示了S. bacillaris细胞壁中的糖基化模式可能更加多样化。此外，S. bacillaris的提取物在蛋白质和多糖的分子量分布上也显示出独特的特征。例如，S. bacillaris的提取物中高分子量蛋白质的含量高于S. cerevisiae的提取物，这可能与S. bacillaris细胞壁的结构特性有关。同时，碱性提取方法在所有三种提取物中表现出最显著的蛋白质稳定性提升效果，表明该方法在工业生产中具有更高的适用性。

研究还发现，不同的提取方法对YCW的降解程度和可溶性成分的回收率存在显著差异。热水提取虽然能够部分释放曼诺蛋白，但其对细胞壁的降解程度较低，因此获得的细胞壁残留物（YCWR）较多。相比之下，酶解提取对细胞壁的降解更为彻底，导致可溶性成分（YCWE）的回收率较低，而残留物（YCWR）的回收率较高。碱性提取则在降解细胞壁和回收可溶性成分方面表现出最优效果，这可能与其对细胞壁结构的破坏性影响有关。同时，碱性提取物中的葡萄糖含量显著高于其他提取物，表明该方法能够有效释放多种糖类成分。

此外，研究还对YCW提取物的分子量分布进行了分析，以进一步理解其在葡萄酒中的功能特性。通过使用高分辨率尺寸排阻色谱（HRSEC）技术，研究人员发现随着提取方法的加强，多糖的分子量逐渐减小。例如，碱性提取物（YCWE_AK）显示出显著的低分子量多糖（7.5–1 kDa）峰，这表明该方法能够有效地释放较小的分子量成分。相比之下，热水提取物（YCWE_A）和酶解提取物（YCWE_E）则表现出较高的中等分子量多糖（180–50 kDa）含量。这些结果表明，不同的提取方法对多糖的分子量分布有显著影响，而酵母种类的差异也在其中起到了重要作用。

研究还评估了这些YCW提取物在葡萄酒中的蛋白质稳定性效果。通过在不同剂量下（20和50 g/hL）对Riesling葡萄酒进行处理，并采用热测试方法评估蛋白质不稳定程度。结果显示，S. bacillaris的碱性提取物（YCWE_AK）在降低浑浊方面表现出最佳效果，其中20 g/hL和50 g/hL剂量分别实现了约17%和35%的浑浊度降低，显著优于S. cerevisiae的提取物。这一结果表明，S. bacillaris的细胞壁衍生物在葡萄酒中的功能表现优于S. cerevisiae，尤其是在碱性处理后。尽管S. bacillaris的提取物在甘露糖与葡萄糖（Man:Glc）比值上较低，但其在蛋白质稳定性方面仍表现出显著优势，这表明比值可能不是唯一决定因素。相反，多糖的分子量、糖基化模式、分支结构和空间构型等因素可能在防止蛋白质浑浊方面起着更为关键的作用。

研究还指出，虽然传统上认为Man:Glc比值是评估曼诺蛋白稳定性的关键指标，但本研究的结果表明，这一比值在非Saccharomyces酵母中可能不如在S. cerevisiae中那样具有预测性。这可能是因为非Saccharomyces酵母的细胞壁组成存在更大的变异性。此外，S. bacillaris的碱性提取物表现出显著的稳定性效果，这与它释放的低分子量多糖的特性有关。这些发现强调了结构与功能之间的复杂关系，并表明在开发新的葡萄酒添加剂时，需要综合考虑多种因素，而不仅仅是单一的糖基化模式。

综上所述，本研究不仅揭示了S. bacillaris细胞壁衍生物在葡萄酒蛋白质稳定性方面的独特优势，还为工业生产提供了更高效和可持续的提取方法。这些发现对葡萄酒工业具有重要的实践意义，特别是在寻找替代传统去蛋白方法方面。此外，本研究还为未来的相关研究提供了方向，例如进一步探索S. bacillaris细胞壁中具体的分子特征，如多糖的分支模式、溶解性和表面电荷等，以优化其在葡萄酒中的应用效果。同时，研究还指出，未来需要评估新型绿色提取技术，如超声波和微波辅助提取、高压均质化和天然深共晶溶剂（NADES）等，以实现更环保的生产方式，并保持与传统碱性提取方法相似的功能效果。这些技术的应用将有助于开发更精确的提取策略和新一代的酵母衍生产品，以提升葡萄酒的质量和稳定性。此外，考虑到酵母衍生物的特性，如类型、制造方法和来源，对葡萄酒香气的影响已被广泛研究，因此未来还需要评估这些S. bacillaris衍生物对葡萄酒香气的潜在影响，以全面了解其技术特性。