丝羽禽（Gallus gallus domesticus Brisson）中的天然黑色素：特性研究及其通过Akt/Nrf2通路保护Caco-2细胞免受氧化应激的作用

《Food Frontiers》：Natural Melanin From Silky Fowl (Gallus gallus domesticus Brisson): Characterization and Protection of Caco-2 Cells From Oxidative Stress via the Akt/Nrf2 Pathway

丝羽乌骨鸡黑色素（MSF）通过激活Akt/Nrf2信号通路，显著降低H2O2诱导的Caco-2细胞氧化损伤，提高细胞存活率（>80%），抑制凋亡（降低至22.43%），并上调SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶活性。同时，MSF修复肠道屏障功能，增强紧密连接蛋白（ZO-1、occludin、claudin）表达及跨膜电阻（TEER）。该研究为开发天然抗氧化剂提供理论依据。

　　丝绸鸡是一种独特的鸡种，其皮肤、肌肉和骨骼呈现黑色，这是由于其体内自然存在的黑色素。在本研究中，我们采用酶解法从丝绸鸡中提取黑色素，并确认其具有独特的抗氧化特性。实验结果显示，过氧化氢（H?O?）会引发细胞内的氧化应激，而丝绸鸡黑色素（MSF）在Caco-2细胞中展现出显著的保护作用。MSF不仅提高了细胞的存活率，还有效减少了细胞凋亡。此外，MSF通过提升细胞内源性抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT和谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px）的活性，同时降低细胞内的活性氧（ROS）水平、乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）含量，表现出显著的抗氧化效果。MSF还增强了Caco-2细胞的屏障功能，并上调了紧密连接蛋白的表达。从机制上来看，MSF降低了p-Akt/Akt的比例，激活了核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路，从而促进细胞在氧化应激条件下的存活。这些发现表明，丝绸鸡黑色素具有强大的抗氧化能力，有望作为合成抗氧化剂的天然替代品应用于功能性食品领域。

### 氧化应激与抗氧化机制的重要性

氧化应激是许多慢性疾病的重要诱因，如阿尔茨海默病、动脉硬化、癌症和心血管疾病。在正常生理状态下，细胞内产生的少量ROS可以被内源性抗氧化系统有效清除，但当ROS的产生超过清除能力时，就会引发氧化应激，导致细胞和组织的损伤。因此，补充外源性抗氧化剂是维持机体正常生理功能和对抗自由基损伤的重要策略。然而，合成抗氧化剂如叔丁基对羟基茴香醚（TBHQ）和丁基羟基茴香醚/对羟基甲苯（BHA/BHT）因可能对人体健康产生不良影响，逐渐被消费者和食品行业所回避。相比之下，天然来源的抗氧化剂因其非毒性、安全性以及丰富的生物活性成分而受到更多关注。

在众多天然抗氧化剂中，植物提取物因其强大的氢供体活性而备受推崇，包括酚酸、酚类二萜、黄酮类化合物、挥发油和植物色素等。然而，动物来源的抗氧化物相对较少，如蜂胶、蜂面包和某些鱼类中的黑色素。因此，探索动物来源的高抗氧化性物质，对于拓展天然抗氧化剂的应用具有重要意义。本研究聚焦于丝绸鸡中的黑色素，旨在评估其作为功能性食品成分的潜力，特别是在抗氧化方面的表现。

### 丝绸鸡黑色素的提取与表征

为了全面研究丝绸鸡黑色素的特性，我们首先需要从其生物环境中分离并纯化黑色素。在这一过程中，酶解法因其对黑色素化学结构的保护作用，成为一种有效的提取手段。传统的酸碱水解法往往导致黑色素的化学结构发生改变，从而降低其纯度和产量。因此，我们采用了一种基于蛋白酶的酶解提取方法，使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胰液提取物对丝绸鸡肌肉组织进行处理，以获得高纯度的黑色素（图1A和图S1）。通过进一步的有机溶剂纯化，每100克组织可以得到约0.14克的纯黑色素。

在对MSF进行表征时，我们使用了先进的成像技术，包括场发射扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM），以观察其形态特征。SEM图像显示，MSF呈现为细小的晶体结构，具有粗糙的表面（图1B）。而TEM图像进一步证实了其椭圆形的结构（图1C）。通过能量色散X射线光谱（EDS）分析，我们发现MSF中碳、氮、氧和硫元素呈现出有序分布，表明其主要成分为黑素（eumelanin），且具有较高的分子量（图1D）。MSF颗粒大小均匀，平均长度约为550纳米，长宽比约为1.9。同时，其平均水动力直径为565纳米，多分散系数（PDI）为0.130，表明其具有良好的分散性（图1E）。此外，MSF的紫外-可见吸收光谱显示其具有典型的无特征吸收峰的单调趋势，随着波长增加而逐渐减弱，表明其分子内部存在较高的共轭结构（图1F）。红外光谱（FTIR）分析则揭示了MSF的多种特征峰，包括O–H或N–H伸缩振动（3370 cm?1）、CH?不对称伸缩振动（2940 cm?1）、CH?对称伸缩振动（2350 cm?1）、C=O伸缩振动或芳香族C=C伸缩振动（1600 cm?1）以及C–N伸缩振动（1370 cm?1），后者是黑色素的典型特征，表明其具有明显的吲哚结构（图1G）。同时，我们检测到脂肪族CH基团（1110 cm?1）和芳香族C–H基团（799 cm?1）以及烯烃C–H基团（727 cm?1），这些结果进一步验证了MSF的化学结构特征。

热重分析（TGA）和导数热重分析（DTG）显示，MSF在220°C以下表现出较高的热稳定性，仅在220°C时出现12%的重量损失（图1H）。在460°C时，MSF开始发生主要的热降解，可能涉及脱羧反应。这一热稳定性特性使得MSF在需要高温处理的食品加工过程中具有应用潜力，例如挤出工艺。综上所述，MSF不仅具有良好的物理化学特性，还表现出优异的热稳定性，为后续的功能性应用奠定了基础。

### MSF对Caco-2细胞存活率的影响

为了评估MSF的抗氧化能力，我们使用CCK-8和LDH实验对Caco-2细胞的毒性进行了检测。实验结果显示，MSF在不同浓度（12.5、50和100 μg/mL）下均未对细胞存活率产生显著影响（p > 0.05），表明其对Caco-2细胞无明显毒性。此外，所有处理组的细胞存活率均高于80%，符合非毒性的标准（Xia et al., 2022），进一步支持了MSF的安全性。值得注意的是，MSF处理后的细胞表现出更好的生长状态和更高的密度，即使在相同的初始细胞数量下，这种现象也表明MSF可能具有促进细胞生长的作用（图S3）。

为了研究MSF对氧化损伤的保护作用，我们采用H?O?（浓度范围为0–2000 μM）诱导Caco-2细胞发生氧化应激，并评估MSF的保护效果。结果显示，H?O?的浓度越高，细胞存活率越低，呈现出剂量依赖性降低的趋势（图S4A）。根据IC??计算，当H?O?浓度达到1000 μM时，Caco-2细胞的存活率下降至约50%（图S4B）。因此，我们选择了1000 μM作为建立氧化损伤模型的条件。随后，我们评估了MSF在不同浓度（12.5、25、50、100和200 μg/mL）下对H?O?诱导的细胞损伤的保护作用。结果显示，MSF在12.5和25 μg/mL时对细胞存活率的保护效果相近，均达到约52%的细胞存活率；而在100和200 μg/mL时，细胞存活率进一步提高至约65%。因此，我们选择12.5 μg/mL作为低剂量组，100 μg/mL作为高剂量组，以评估MSF的剂量依赖性保护作用（图2C）。

### MSF对氧化应激标志物的影响

为了进一步评估MSF对氧化应激的缓解作用，我们检测了ROS水平和MDA含量。ROS是衡量细胞内氧化应激程度的重要指标，而MDA是ROS诱导的脂质过氧化的产物，常被用作间接评估氧化损伤的标志物。在H?O?处理后，Caco-2细胞中的ROS水平显著上升，达到1.31 ± 0.05，表明氧化应激程度明显增强（图3C）。同时，MDA含量也显著增加，从193.82 ± 29.13升至578.16 ± 25.71 μmol/mg，说明细胞膜受到了严重损伤（图3B）。然而，MSF处理后，这些指标显著降低。例如，MSF在12.5 μg/mL时将MDA含量降低至8.59%–45.77%，在100 μg/mL时降低效果更为明显（图3B和图3E）。此外，MSF处理后，ROS水平显著下降，分别降至1.21 ± 0.03、1.14 ± 0.01和1.06 ± 0.02，表明MSF具有显著的ROS清除能力（图3C和图3D）。

### MSF对抗氧化酶活性的影响

除了直接清除ROS外，MSF还通过增强细胞内源性抗氧化酶的活性来发挥保护作用。SOD、CAT和GSH-Px是细胞中重要的抗氧化酶，分别负责将超氧阴离子（O??）和过氧化氢（H?O?）转化为相对无害的产物（如O?和H?O）。在H?O?处理后，这些酶的活性显著下降，其中SOD活性从1.61 ± 0.15 U/mg蛋白降至0.28 ± 0.01 U/mg蛋白（p < 0.01），CAT活性从242.54 ± 5.98 U/mg蛋白降至96.51 ± 2.53 U/mg蛋白（p < 0.01），GSH-Px活性从650.44 ± 18.84 U/mg蛋白降至281.26 ± 31.76 U/mg蛋白（p < 0.01）。这些结果表明，H?O?对Caco-2细胞的抗氧化系统造成了显著的损害。然而，MSF处理后，这些酶的活性显著恢复，其中SOD活性从0.39 ± 0.05 U/mg蛋白提升至1.03 ± 0.06 U/mg蛋白，CAT活性从96.51 ± 2.53 U/mg蛋白提升至188.28 ± 3.04 U/mg蛋白，GSH-Px活性从281.26 ± 31.76 U/mg蛋白提升至302.05 ± 28.79、498.68 ± 22.21和494.30 ± 20.14 U/mg蛋白。这些结果表明，MSF通过调节抗氧化酶的活性，显著减轻了H?O?引起的氧化损伤，从而保护细胞免受自由基的侵害。

### MSF对细胞凋亡和线粒体膜电位的影响

细胞凋亡是细胞在受到损伤或异常信号刺激时的一种程序性死亡过程，对维持机体稳态具有重要意义。然而，过度的氧化应激可能导致细胞凋亡增加，从而影响组织功能。在本研究中，我们通过Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测了MSF对Caco-2细胞凋亡率的影响。结果显示，H?O?处理后，Caco-2细胞的凋亡率显著上升，达到52.93% ± 2.62，主要表现为晚期凋亡（图4A）。然而，MSF处理后，细胞凋亡率显著下降，其中12.5 μg/mL时凋亡率降至39.30% ± 0.82，50 μg/mL时降至27.67% ± 1.35，100 μg/mL时降至22.43% ± 1.12（图4B）。这些结果表明，MSF在降低细胞凋亡方面具有显著的保护作用。

线粒体膜电位（MMP）是细胞凋亡的重要指标，其降低通常预示着线粒体功能受损和细胞凋亡的启动。在H?O?处理后，Caco-2细胞的MMP显著下降，说明线粒体功能受到了严重干扰（图4F）。然而，MSF处理后，MMP显著恢复，表明其有助于维持线粒体的完整性。同时，我们发现MSF处理后，细胞的形态得到了显著改善，包括细胞密度增加、细胞连接增强以及细胞结构恢复至接近正常状态（图2F–J）。这些结果进一步支持了MSF在缓解氧化应激和保护细胞功能方面的有效性。

### MSF对肠上皮屏障功能的影响

为了评估MSF对肠上皮屏障功能的保护作用，我们采用Caco-2细胞模型进行实验。Caco-2细胞是研究肠道屏障功能的常用模型，其能够形成类似人体小肠上皮的单层结构。我们通过测量跨上皮电位阻力（TEER）来评估细胞屏障的完整性。在正常培养条件下，TEER值逐渐上升，最终在第21天达到稳定状态（约610 Ω/cm2），表明细胞单层结构已经形成（图S5）。当细胞暴露于H?O?后，TEER值显著下降，说明屏障功能受到了破坏。然而，MSF处理后，TEER值显著恢复，表明其有助于维持肠上皮屏障的完整性（图5A）。

此外，我们检测了紧密连接蛋白（如ZO-1、occludin和claudin）的表达水平。H?O?处理后，这些蛋白的表达显著下降，而MSF处理后，其表达水平显著恢复（图5C–F）。这表明MSF能够通过上调紧密连接蛋白的表达，增强细胞间的连接，从而提高屏障功能。同时，我们还检测了这些蛋白的mRNA表达水平，发现其与蛋白表达水平呈正相关（图5G–K）。这些结果进一步支持了MSF在修复肠上皮屏障方面的潜力。

### MSF通过Akt/Nrf2信号通路发挥抗氧化作用

为了探究MSF的抗氧化机制，我们进一步研究了其对Akt/Nrf2信号通路的影响。Akt是细胞存活和凋亡调控中的关键信号分子，其磷酸化水平通常与细胞的生存能力相关。在H?O?处理后，Caco-2细胞中的p-Akt/Akt比值显著上升，达到1.74 ± 0.10，表明氧化应激导致了Akt的激活。然而，MSF处理后，这一比值显著下降，分别为1.56 ± 0.05、1.35 ± 0.16和1.24 ± 0.17，表明MSF能够有效抑制Akt的磷酸化（图6A、B）。为了验证这一结论，我们采用siRNA技术抑制Akt的表达，并观察MSF的保护作用是否受到影响。结果表明，当Akt被抑制后，MSF的保护作用显著减弱，说明Akt信号通路在MSF的抗氧化机制中起着关键作用（图6C–L）。

Nrf2是细胞应对氧化应激的重要转录因子，其在细胞质中与Keap1结合，抑制其核转位。当细胞受到氧化应激刺激时，Nrf2从细胞质转移到细胞核，激活抗氧化反应元件（ARE）驱动的基因表达，从而增强细胞的抗氧化能力。我们的实验结果显示，MSF处理后，细胞质中的Nrf2表达水平显著下降，而细胞核中的Nrf2表达水平显著上升，表明MSF促进了Nrf2的核转位（图7A、B）。同时，Keap1的表达水平显著上升，与细胞质中的Nrf2水平呈负相关，进一步支持了Nrf2的激活机制。Nrf2的激活导致其下游抗氧化酶（如NQO1、HO-1和GCLC）的表达显著增加，这些酶的活性在MSF处理后也得到了显著提升（图7E–K）。这些结果表明，MSF通过激活Akt/Nrf2信号通路，增强了细胞的抗氧化能力，从而有效保护细胞免受氧化应激的损伤。

### MSF的细胞摄取机制

为了进一步理解MSF在细胞内的作用机制，我们研究了其进入Caco-2细胞的途径。Caco-2细胞可以通过多种方式摄取物质，包括被动扩散、细胞间运输、跨细胞运输和内吞作用。我们通过使用特定的内吞抑制剂（如EIPA、CPZ和MβCD）来分析MSF的摄取机制。结果显示，CPZ对MSF的摄取没有明显影响，表明其主要不是通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。然而，EIPA和MβCD的预处理显著降低了MSF的摄取率，表明大吞饮作用和脂筏介导的内吞作用是MSF进入Caco-2细胞的主要途径（图8B）。这一结果与MSF的较大粒径（>200 nm）及其不溶性特性相吻合，表明其在细胞内的摄取主要依赖于大吞饮和脂筏介导的机制，而非网格蛋白介导的内吞作用。

在MSF进入细胞后，其表现出显著的抗氧化活性，这一活性通过改变氧化应激相关参数和细胞信号蛋白得以体现（图8C）。我们发现，ROS和MDA水平与抗氧化酶（如SOD、CAT和GSH-Px）的活性呈显著负相关，表明MSF可能通过上调这些酶的表达来间接清除ROS。此外，抗氧化酶的活性与Nrf2的下游靶标（如HO-1、GCLC和NQO1）的表达水平呈正相关，进一步支持了MSF通过激活Nrf2信号通路增强抗氧化能力的机制。同时，ROS和MDA水平与紧密连接蛋白（ZO-1、occludin和CLDN）的表达呈负相关，表明氧化应激会破坏紧密连接蛋白的结构，导致肠道屏障功能受损。MSF的保护作用可能部分归因于其对这些蛋白表达的上调，从而维持肠道屏障的完整性（图8D）。

### 结论与展望

综上所述，丝绸鸡黑色素（MSF）具有显著的抗氧化能力，能够在H?O?诱导的氧化应激条件下有效保护Caco-2细胞，提高其存活率并减少凋亡。其作用机制涉及对Akt/Nrf2信号通路的调节，通过降低p-Akt/Akt比值和上调Nrf2的核转位，增强细胞内源性抗氧化酶的活性，从而有效清除ROS并减轻氧化损伤。此外，MSF还通过上调紧密连接蛋白的表达，增强细胞间的连接，从而改善肠道屏障功能。这些发现不仅揭示了MSF的生物学活性，还为其在功能性食品领域的应用提供了理论依据。

尽管本研究已经证明了MSF的抗氧化潜力，但仍需进一步开展体内实验以验证其在生物体内的实际效果。此外，关于MSF在不同食品体系中的稳定性和生物利用度的研究也具有重要意义。未来的研究可以围绕这些方面展开，以评估MSF在实际应用中的可行性，并探索其在食品加工和营养补充中的具体作用。同时，对MSF的长期安全性和潜在副作用的评估也是必不可少的。总之，本研究为开发天然抗氧化剂提供了新的思路，也为丝绸鸡的高价值利用奠定了基础。