由中国根霉（Rhizopus chinensis）和DU-106芽孢杆菌（Bacillus sp. DU-106）共同发酵的大豆种子制剂，通过调节钙信号通路和肠道微生物群，缓解洛哌丁胺（Loperamide）诱导的大鼠便秘症状

《Food Frontiers》：Sojae Semen Praeparatum Fermented by Rhizopus chinensis and Bacillus sp. DU-106 Alleviates Loperamide-Induced Constipation in Rats via Regulating Calcium Signaling Pathways and the Gut Microbiota

本研究采用双菌发酵制备新型SSP，通过诱导性便秘SD大鼠模型，证实SSP通过调节钙信号通路（ADRB2、IP3R、PKC等）和改善肠道菌群（增加Bacteroidota、Lactobacillus等）及产SCFAs能力，显著缓解便秘症状，为传统食品的功能开发提供新方向。

　　便秘是一种常见的慢性功能性消化系统疾病，严重影响人们的健康生活质量，影响全球约15%的人口（S. Liang, He, et al. 2024；Mukai 2018）。它可能由多种因素引起，包括膳食纤维摄入不足、药物（如阿片类药物）或某些疾病（Md et al. 2023；S. S. Zhang et al. 2017）。长期便秘可能导致痔疮、肛裂，甚至在严重情况下影响肠道菌群平衡，不仅降低生活质量，还可能对心理健康造成影响，导致抑郁（P. Wang, Shen, et al. 2023；Lv et al. 2019）。目前，治疗便秘的方法包括使用泻药（如容积性泻药、高渗性泻药、盐类泻药和刺激性泻药），以及处方药物如鲁比前列酮（Amitiza）和利那洛肽（Linzess）（Guan et al. 2024）。然而，这些传统治疗方法存在一些局限性，包括疗效不稳定、成本较高以及不良反应（Akriche et al. 2020；Wald 2016），其中恶心和呕吐尤为常见（Viscusi 2019）。因此，寻找更安全、有效的解决方案变得尤为重要。

许多研究表明，天然植物的水提取物以及这些植物中的某些活性成分在缓解便秘方面具有显著效果和安全性。例如，肉苁蓉的水提取物通过调节SCF（短链脂肪酸）和C-kit蛋白的表达，增加粪便量和水分含量，改善胃肠传输，并增强间质细胞（ICC）的功能（S. Liang, He, et al. 2024）。同时，桃仁提取物与多酚的结合不仅促进胃肠蠕动，还调节特定肠道菌群，上调SCF和C-kit表达，抑制NF-κB信号通路中的炎症介质，从而缓解便秘（S. Liang, He, et al. 2024；Yan et al. 2017）。此外，传统中药制剂也为便秘的治疗提供了新的视角。例如，由何首乌、芦荟、决明子和枸杞组成的首荟通便胶囊（SHTB）能够有效改善便秘症状并促进胃肠蠕动（Bai et al. 2022）。尽管已有多种植物活性成分和中药制剂被证明有助于缓解便秘，但它们在缓解便秘方面的具体作用机制仍不明确。

近年来，传统发酵食品因其独特的健康益处而受到关注，特别是在治疗便秘方面的潜力（Feng et al. 2023；C. L. C. Liu et al. 2017）。许多研究表明，发酵食品通过调节肠道菌群组成来缓解便秘（Leeuwendaal et al. 2022；Rezac et al. 2018）。例如，由Trichoderma孢子悬浮液发酵的豆渣膳食纤维可以调节肠道菌群平衡，从而治疗便秘（L. Wu et al. 2023）。不同益生菌发酵的酸奶是改善慢传输性便秘的优良功能性食品（C. L. C. Liu et al. 2017）。然而，关于发酵食品在改善便秘方面的研究仍较少，因此寻找更多具有足够疗效的发酵食品成为新的研究方向。

大豆种子制备物（SSP）是一种具有药用和食用双重功能的传统发酵食品，富含多种生物活性营养物质，包括蛋白质、必需氨基酸、维生素和膳食纤维。传统的SSP由黑豆、黄花蒿和桑叶等作为原料制成（Du 2022）。它具有降低血压、缓解抑郁和调节肠道菌群等益处（Guo et al. 2023；L. Zhang et al. 2024）。最近的研究主要集中在发酵过程中黄酮类和等同于黄酮的异黄酮成分含量的变化及其功效（Falkenhain et al. 2023）。同时，在早期研究中，我们制备了一种具有溶解血栓作用的轻质浆状粉末（CN105661338A）。然而，关于SSP改善便秘的效果和机制的报道仍然有限。因此，本研究首次开发了一种新型SSP，通过用莲叶和决明子的药汤浸泡黑豆，随后采用Rhizopus chinensis和Bacillus sp. DU-106进行双发酵。其中，Rhizopus chinensis具有强大的孢子形成能力、高孢子数量、快速生长速率、小孢子囊孢子以及产生高活性溶栓酶的能力（X. T. He, Wu, et al. 2022）。Bacillus sp. DU-106则表现出较强的抗压能力、高温和酸耐受性、易于储存以及优良的发酵特性。它已被应用于水果酒、饮料和中药的发酵过程中（J. Z. Huang, Liang, et al. 2018；S. S. Wu et al. 2019），并显示出降低血脂水平和缓解腹泻的潜力（Lai et al. 2022）。与传统方法相比，这种新方法旨在利用Rhizopus chinensis分解豆类中的大分子（如蛋白质、多糖等）为更易被吸收的形式，同时利用Bacillus sp. DU-106丰富发酵产物的营养组成（如增加益生菌含量和有益代谢物），从而改善肠道菌群组成并促进肠道蠕动，达到通便效果。随后，使用洛哌丁胺诱导的SD大鼠便秘模型进一步揭示了SSP在改善便秘中的作用及其分子机制。

在本研究中，我们采用了一种新型的SSP制作方法，即通过Rhizopus chinensis和Bacillus sp. DU-106进行双发酵。与传统的发酵黑豆（豆豉）相比，新型SSP的活性成分含量更高，特别是总酚类物质和膳食纤维（见附表S1）（J. Zhang, Gao, et al. 2022）。研究显示，总酚类物质和膳食纤维含量的增加有助于提高粪便体积，促进肠道蠕动，从而缓解便秘（Hagan et al. 2021；Morris 2017）。这些结果表明，通过新工艺制备的SSP在治疗便秘方面具有潜在的疗效。因此，我们使用洛哌丁胺诱导的SD大鼠便秘模型，探讨SSP对便秘的改善作用。

与正常对照组（NC）相比，模型对照组（MC）大鼠在模型建立后体重增长缓慢，食物和饮水摄入量减少。然而，在SSP干预后，各剂量组大鼠体重增长和食物摄入量显著增加（图1b-d）。如图1e、f所示，MC组大鼠的粪便硬度较高，粪便水分含量较低。经过SSP治疗后，粪便硬度下降，水分含量增加，表明SSP可能通过增加粪便水分、软化粪便、降低粪便硬度和促进排便来缓解便秘。在排便功能方面，粪便水分含量通常被认为是最重要的指标之一（Qi et al. 2023）。我们的研究结果表明，所有测试剂量的SSP均显著提高了便秘大鼠的粪便水分含量。此外，红便排出试验和小肠推进试验的结果也显示，SSP显著缩短了便秘大鼠的排便时间并增加了小肠推进力。便秘通常与胃肠传输时间延长、肠道平滑肌异常收缩、蠕动减慢以及肠道神经递质分泌紊乱密切相关（H. Liu et al. 2021；X. Zhang, Zheng, et al. 2021）。其中，兴奋性神经递质如胃泌素（GAS）、促胃液素（MTL）、物质P（SP）和5-羟色胺（5-HT）可以放松幽门括约肌并刺激胃肠蠕动。然而，在便秘患者中，这些神经递质的水平显著降低。相反，抑制性神经递质如VIP和SS则延长了胃肠传输时间（S. Liang, He, et al. 2024；Zhao et al. 2021）。我们的研究结果表明，SSP治疗显著缩短了便秘大鼠的肠道传输时间，并增加了小肠推进率，同时上调了MTL、GAS、SP和5-HT的水平，下调了SS和VIP的水平（图2）。这些结果表明，SSP能够有效增强胃肠蠕动，调节肠道神经递质的分泌，从而缓解便秘。类似地，Wang等人（2021）也发现，菊花中的多糖对便秘具有有益作用，通过提高MTL、GAS和SP的水平以及降低SS的浓度来改善便秘。

值得注意的是，便秘还可能引发肠道炎症，影响结肠杯状细胞数量和黏膜完整性（L. S. Huang, Kong, et al. 2018；Johansson and Hansson 2016）。SSP可以通过增加杯状细胞数量和增厚黏膜层来修复结肠结构。其潜在机制可能涉及抑制结肠组织中的NO合成酶（NOS）活性和ATP酶活性（如Ca2?-ATPase）（H et al. 2019；Jin et al. 2016；Yi et al. 2019；Q. Zhang, Zhong, et al. 2021）。具体而言，SSP显著降低了结肠组织中NOS的活性。这种调节可以减少抑制性神经递质NO的产生，缓解其对结肠平滑肌的放松作用，从而促进结肠蠕动。同时，SSP还能显著降低结肠组织中的ATP酶活性。维持平滑肌细胞的离子稳态可以增强平滑肌的收缩功能，提高肠道蠕动能力，从而缓解便秘（图3和图4）。这一机制与Niu等人（2022）的研究结果一致，即厚朴通过钙调节放松平滑肌（Niu et al. 2022）。

便秘还与肠道菌群失调密切相关（Afzaal et al. 2022；P. Wang, Shen, et al. 2023；J. Zhang, Gao, et al. 2022）。值得注意的是，不同的加工方法和药汤对菌群的影响显著，尤其是在Blautia菌的丰度方面（Sadia Ahmed 2022）。先前的研究表明，使用不同药用辅料发酵的豆制品在治疗代谢性疾病方面具有独特优势（L. Zhang et al. 2024）。在本研究中，我们采用16S rRNA基因扩增子测序技术，分析了SSP干预后肠道菌群的变化。α-和β-多样性分析结果表明，SSP灌胃能够有效重塑洛哌丁胺诱导便秘大鼠的肠道菌群结构，使其接近健康对照组的菌群特征。此外，研究还发现，便秘大鼠在门水平上表现出Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比例下降，这是人类肠道菌群中在能量转换、营养吸收调节和葡萄糖代谢中起关键作用的重要菌群（Koliada et al. 2017）。SSP治疗显著降低了Bacteroides的相对丰度，从而提高了F/B比例。据报道，猕猴桃中的多糖和多酚能够提高便秘小鼠粪便中Bacteroidetes的丰度，降低Firmicutes的丰度（Ge et al. 2017）。有趣的是，SSP治疗后，便秘大鼠的有益菌如Lactobacillus和Romboutsia的丰度显著增加。这些菌群已被证实能够产生短链脂肪酸（SCFAs），促进肠道蠕动并对抗炎症（Chen et al. 2022；P. Wang, Shen, et al. 2023）。Jang等人（2024）也发现，乳果糖能够正向调节盲肠菌群组成，增加Bifidobacterium、Lactobacillus和Romboutsia的相对丰度，同时减少Prevotella和Ruminococcus的相对丰度。总之，SSP治疗显著提高了便秘大鼠的肠道菌群多样性，并增加了有益菌如Lactobacillus和Romboutsia的丰度，从而促进肠道蠕动和排便。

短链脂肪酸（SCFAs）如乙酸、丙酸和丁酸在缓解便秘方面起着关键作用。它们不仅为结肠上皮细胞提供能量并维持体液-电解质平衡，还能调节肠道菌群（X. Zhang, Zheng, et al. 2021），刺激肠道蠕动，并通过增加肠道渗透压促进水分吸收（Konen et al. 2021）。丙酸能够减少脂肪生成、降低血清胆固醇水平并减少致癌效应；乙酸能够增强宿主肠道上皮细胞的屏障功能；丁酸则是大肠的主要代谢能源，能够改变粪便的性状，从而缓解排便时的疼痛或不适（Chu et al. 2019；Martin-Gallausiaux et al. 2021；Zhan et al. 2022）。我们的研究结果显示，所有SSP治疗组的SCFAs水平普遍升高，主要体现在乙酸、丙酸和丁酸的增加。这些结果表明，SSP能够增加SCFAs水平，从而改善便秘（Wang et al. 2020）。最后，Spearman相关性分析表明，促进排便的指标与Blautia、Staphylococcus、Collinsella和Prevotella 9呈负相关，而与Lachnospiraceae NK4A136、Romboutsia、Weissella、NK4A214和SCFAs呈正相关。这进一步证实了SSP可能通过调节与SCFAs代谢相关的肠道菌群和胃肠信号因子来增强胃肠蠕动，与之前的研究结果一致。具体而言，Blautia可能通过过度激活MTL或引发肠道炎症来抑制排便，而产生SCFAs的菌群如Lachnospiraceae NK4A136则通过增加肠道渗透压和刺激肠道黏膜蠕动来促进排便。Romboutsia则通过提高MTL和GAS的水平直接增强肠道蠕动。此外，Subdoligranulum与FW（粪便重量）和ITR（肠道传输率）呈正相关，表明其能够增加粪便水分含量，从而提高传输效率。Lactobacillus与MTL和VIP呈正相关，但其对蠕动的双向影响需要平衡。总之，这些肠道菌群通过调节SCFA代谢和胃肠信号因子，介导了SSP对便秘的改善作用（Guan et al. 2024；Lin et al. 2022）。

综上所述，本研究证明SSP在改善便秘方面具有显著效果。SSP治疗能够通过促进胃肠蠕动、激活与钙信号通路相关的蛋白质表达以及调节特定肠道菌群来维持肠道健康。这项研究为SSP相关功能产品的开发提供了理论基础。未来的研究可以进一步通过临床试验验证SSP在治疗便秘中的效果，并深入探索其抗便秘作用的活性成分。