在混合模式SAX固定相上，利用二维液相色谱技术，对Patisiran进行温度控制的非变性分析与变性分析之间的转换

《Journal of Chromatography A》：Temperature-controlled transition between non-denaturing and denaturing analysis of Patisiran on a mixed-mode SAX stationary phase utilizing two-dimensional liquid chromatography

siRNA双链分析需结合非去卷曲与去卷曲色谱条件，本文通过自研三苯基膦基混合模式SAX柱，实现同一柱子温度调控（20°C非去卷曲/80°C去卷曲）完成双链与单链分离，验证温度对siRNA熔解温度的影响，并建立2D-LC heart-cutting方法同步检测双链纯度及单链杂质，符合EMA oligonucleotide质量控制指南要求。

　　siRNA（小干扰核糖核酸）作为一类新兴的核酸药物，其在生物医学领域的应用前景广阔。随着近年来对siRNA治疗药物研究的深入，越来越多的siRNA分子被开发并进入临床试验阶段。因此，建立一种高效、可靠、且能准确表征这些化合物的分析方法变得尤为重要。siRNA通过与RNA诱导的沉默复合物（RISC）结合，从而调控目标mRNA的表达，这种作用机制使其在治疗多种疾病方面展现出巨大潜力。然而，由于siRNA的双链结构容易受到外界条件的影响，如温度、有机溶剂、离子对试剂等，因此在分析过程中需要兼顾非变性条件和变性条件，以确保对siRNA质量属性（CQAs）的全面评估。

非变性条件下的分析主要关注siRNA双链结构的完整性，而变性条件则用于揭示其单链成分以及可能存在的杂质。当前，离子对反相高效液相色谱（IP-RPLC）是用于siRNA分析的主流方法，因为它能够在高温、高浓度离子对试剂和有机溶剂（如乙腈）的作用下实现高效的分离。然而，这种条件通常会导致siRNA双链结构的解离，因此无法直接用于非变性分析。为了克服这一局限，研究者尝试在非变性条件下分析siRNA双链结构，例如通过降低温度、使用弱相互作用的离子对试剂或采用特定的色谱模式。

在本研究中，我们评估了混合模式的三苯基膦基SAX（强阴离子交换）色谱柱在非变性条件下的应用潜力。该色谱柱具有独特的表面化学特性，包括三苯基膦基团和硅烷化基团，能够同时与siRNA的阴离子和疏水性相互作用。这种设计使得siRNA双链能够在较低温度下保持稳定，从而实现非变性条件下的分析。实验表明，在10°C的条件下，Patisiran的双链结构保持完整，而单链则显示出更强的保留效应，这可能是由于单链具有更高的构象灵活性和更广泛的与色谱柱表面的相互作用。

此外，我们还探讨了温度变化对siRNA双链稳定性的影响。在不同温度下，Patisiran的双链结构表现出不同的分离行为。例如，在55°C时，双链开始部分解离，单链峰开始出现；而在60°C时，双链和单链峰之间出现了平台效应，表明双链和单链之间存在可逆的相互转化过程。随着温度进一步升高至70°C，双链完全解离，仅能检测到单链。这一现象说明，温度是影响siRNA双链稳定性的关键因素，同时色谱柱的化学性质也对双链的保留行为产生重要影响。

为了进一步提高分析效率，我们提出了一种二维液相色谱（2D-LC）方法，即在第一维使用非变性条件下的三苯基膦基SAX色谱柱，而在第二维切换为变性条件下的色谱柱，从而实现对siRNA双链及其单链成分的同步分析。这种方法不仅能够检测siRNA的纯度，还可以评估单链残留情况，为siRNA药物的质量控制提供了一种新的解决方案。实验结果显示，通过温度调控，可以在同一色谱柱上实现非变性和变性条件的切换，从而提高分析的全面性和效率。

在非变性条件下，三苯基膦基SAX色谱柱展现出优异的分离性能。例如，在10°C时，Patisiran的双链结构保持完整，而单链则显示出更广泛的保留行为。这可能与单链在色谱柱上的多重相互作用有关，包括与色谱柱表面的疏水性和芳香环之间的π-π堆积作用。相比之下，在变性条件下，由于高温和有机溶剂的存在，双链结构解离，单链则表现出更高的保留强度，但它们之间的分离度较低，几乎完全共洗脱。这表明，变性条件下的分析更适用于检测单链成分，而非变性条件下的分析则更适合评估双链的稳定性。

为了验证三苯基膦基SAX色谱柱在非变性条件下的分析能力，我们进行了单链残留的定量实验。通过向双链中添加不同比例的单链（如10%的单链过量），我们评估了该色谱柱在非变性条件下的检测精度和准确性。实验结果表明，该色谱柱能够有效地检测单链过量，并且具有良好的重复性和稳定性。这一发现为siRNA药物的纯度评估提供了新的思路，同时也为优化非变性条件下的分析方法提供了依据。

此外，我们还比较了三苯基膦基SAX色谱柱与传统四甲基铵基SAX色谱柱在非变性条件下的表现。结果表明，三苯基膦基SAX色谱柱由于其疏水性增强，能够提供更稳定的双链保留行为，从而在较低的盐浓度下实现有效的分离。这进一步说明，色谱柱的化学结构对siRNA双链的稳定性具有重要影响，选择合适的色谱柱可以显著提高分析的准确性和可靠性。

综上所述，本研究探讨了三苯基膦基SAX色谱柱在非变性条件下的应用潜力，并通过温度调控实现了对siRNA双链及其单链成分的同步分析。这一方法不仅能够有效评估siRNA药物的质量属性，还为优化非变性条件下的分析流程提供了新的思路。未来的研究可以进一步探索不同色谱柱和实验条件对siRNA双链稳定性的影响，以期开发出更加高效和可靠的分析方法。