利用液相色谱-电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱联用技术对栽培和野生马铃薯块茎外皮中的酰基溶胺进行分析

《JOURNAL OF MASS SPECTROMETRY》：Analysis of Acyl Solamines in Tuber Periderm of Cultivated and Wild Potatoes Using Liquid Chromatography Coupled With Electrospray Ionization Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometry

本文开发了一种基于所有离子碎裂的UHPLC/ESI-QTOFMS非靶向筛查方法，用于鉴定马铃薯块茎皮层中超过20种酰基托品烷及其衍生物，包括短链、中链脂肪酸酰基托品烷、羟基肉桂酰基托品烷等，并检测到含氮氧化及去甲基化修饰的次要衍生物。方法结合质谱特征离子和碰撞诱导解离谱图解析结构，首次在野生马铃薯中鉴定出高浓度C10:1(2Z)-酰基托品烷，证实其具有抗虫和抗晚疫病活性，为植物次生代谢物研究提供新工具。

　　在植物化学领域，酰基溶胺是一类较为少见的生物碱，它们在多种茄科植物中被发现。这类化合物的结构特点在于其具有一个具有两个叔丁基胺基的溶胺头基团，以及一个长链脂肪酸基团。由于它们在自然界中的分布较为有限，且化学性质复杂，因此关于它们的系统研究相对较少。本文提出了一种基于全离子碎片化的通用筛查方法，用于检测这类化合物，并应用于对三个茄科植物的块茎外皮提取物进行分析，包括栽培土豆品种（Solanum tuberosum）和两个野生茄科植物物种（Solanum pinnatisectum 和 Solanum cardiophyllum）。该方法成功鉴定了超过20种酰基溶胺，包括短链和中链脂肪酰基溶胺、羟基肉桂酰基溶胺以及其他芳香酰基溶胺。此外，还检测到了一些含有N-氧化溶胺基团（如酰基溶胺-N-氧化物和双N-氧化物）以及N-去甲基化溶胺基团（如酰基去甲基溶胺和双去甲基溶胺）的次要衍生物。这些化合物在正离子电喷雾电离条件下形成单电荷和双电荷分子，其碎片离子光谱在碰撞诱导解离（CID）后表现出高度信息性和易于解释的特征。这一结果使得溶胺头基团的结构鉴定成为可能，某些情况下甚至可以进一步鉴定脂肪酸基团的结构。为了确定碳-碳双键的位置，研究人员对来自栽培土豆的某些中链脂肪酰基溶胺进行了微量分离，并通过使用meta-氯过苯甲酸（m-CPBA）进行氧化处理，随后对氧化产物的CID质谱进行了分析，从而提供了进一步结构鉴定的关键信息。

在栽培和野生土豆的块茎外皮中，酰基溶胺的种类和含量显示出一定的差异。例如，C10:1-溶胺（编号10a）是栽培土豆和S. pinnatisectum中含量最高的中链脂肪酰基溶胺，而C6:0-溶胺（编号2a）则在S. cardiophyllum中最为丰富。此外，检测到一些具有氧化溶胺头基团的次要衍生物，如C6:0-溶胺-N-氧化物（编号2b）和C6:0-溶胺双N-氧化物（编号2c），以及C10:1-溶胺-N-氧化物（编号10b）和C10:1-溶胺双N-氧化物（编号10d）。这些衍生物在块茎外皮中的浓度通常较低，但它们的结构特征为研究酰基溶胺的多样性提供了重要的信息。值得注意的是，虽然S. pinnatisectum的块茎外皮中存在大量羟基肉桂酰基溶胺，但并未检测到其N-氧化物或双N-氧化物形式。

在对这些酰基溶胺及其衍生物的分析中，研究人员发现其保留行为通常遵循反相色谱中脂质的保留模式。随着脂肪酸链长的增加，保留时间呈线性增长，而双键数量和脂肪酸的氧化程度则导致保留时间的减少。例如，具有双键的化合物在保留时间上比饱和脂肪酸衍生物更短。然而，当溶胺头基团中的N-甲基基团数量逐渐减少时，其保留时间反而会增加。这种保留行为的变化对于理解酰基溶胺在不同植物组织中的分布及其可能的生物功能具有重要意义。

通过使用全离子碎片化（AIF）方法，研究人员能够在正离子模式下高效地筛选这些化合物。在AIF方法中，质谱数据在低和高碰撞能量下交替记录，无需预先选择前体离子。这种方法在检测中链脂肪酰基溶胺及其衍生物时表现出高度的敏感性，其中以m/z 100.112处的Me?Py?离子最为常见。该离子可以作为酰基溶胺及其衍生物的特征标志，用于快速筛查。然而，对于某些N-氧化衍生物，如双N-氧化物，其在m/z 100.112处的离子丰度较低，因此需要使用其他标志离子，如m/z 126.128处的e?离子，以进行更全面的检测。不过，这种离子的相对强度仅为前者的大约10%，因此在检测灵敏度上有所降低。

为了进一步理解酰基溶胺的碎片化行为，研究人员对不同碰撞能量下的碎片离子光谱进行了详细分析。在25 V碰撞能量下，所有检测到的化合物都表现出丰富的Me?Py?离子，这成为其碎片化过程中的主要特征。而随着碰撞能量的增加，例如在40 V时，一些衍生碎片离子（如酰基离子及其相关碎片）的丰度显著提高，这有助于进一步解析脂肪酸基团的结构。例如，在C10:1-溶胺（编号10b）的40 V CID质谱中，观察到了多个与咖啡酰基团相关的特征离子，如m/z 163.039、m/z 145.028、m/z 135.044和m/z 117.033。这些离子的出现表明，酰基溶胺的碎片化过程不仅涉及溶胺头基团的分解，还包括脂肪酸基团的断裂。

在研究中，还发现了一些含有N-氧化或N-去甲基化溶胺头基团的化合物，如C10:1-溶胺-N-氧化物（编号10b）和C10:1-溶胺双N-氧化物（编号10c）。这些化合物在碎片化过程中表现出与普通酰基溶胺相似的行为，但其碎片离子的相对丰度和位置有所不同。例如，在C10:1-溶胺-N-氧化物的CID质谱中，Me?Py?离子的丰度显著降低，而其他离子如a?和b?则相对更加突出。这表明，N-氧化可能会影响碎片离子的形成路径和相对丰度。此外，一些N-去甲基化衍生物（如C10:1-去甲基溶胺）的碎片离子光谱与N-氧化物有所不同，这为区分不同类型的衍生物提供了依据。

对于某些具有氧化溶胺头基团的化合物，如C10:1-溶胺-N-氧化物和C10:1-溶胺双N-氧化物，它们的碎片化行为表现出独特的特征。例如，在C10:1-溶胺双N-氧化物的CID质谱中，Me?Py?离子的丰度较低，而其他离子如e?则更加显著。这可能与溶胺头基团中N-甲基基团的缺失有关，从而影响了碎片离子的形成路径。此外，一些具有氧化溶胺头基团的化合物在碎片化过程中形成了独特的离子，如[MePy+H]?和[Py+H]?，这些离子的出现为解析其结构提供了额外的线索。

对于具有双键的中链脂肪酰基溶胺，如C10:2-溶胺（编号12a和12b），研究人员通过使用m-CPBA进行氧化处理，并分析其氧化产物的CID质谱，进一步明确了其双键的位置。例如，在C10:2-溶胺的氧化产物中，观察到特定的碎片离子，如m/z 222.149、m/z 208.133和m/z 192.138，这些离子的形成表明双键位于脂肪酸链的特定位置。通过对比这些碎片离子的相对丰度和位置，研究人员推测C10:2-溶胺（编号12b）的双键位于C-2和C-3之间。然而，对于C10:2-溶胺（编号12a），由于其反应产物的多样性有限，双键的确切位置仍需进一步研究。

总体而言，本文提出的方法为酰基溶胺及其衍生物的快速、非靶向筛查提供了有效的工具。通过结合反相超高效液相色谱（UHPLC）和电喷雾电离四极杆飞行时间质谱（ESI-QTOFMS）技术，并利用全离子碎片化策略，研究人员能够识别出多种酰基溶胺及其衍生物，并对其结构特征进行分析。这种方法不仅提高了检测的灵敏度，还为研究这些化合物在植物中的分布及其可能的生物活性提供了新的视角。此外，通过氧化处理和碎片化分析，研究人员还能够部分确定某些中链脂肪酰基溶胺中双键的位置，为理解其在植物防御机制中的作用提供了依据。

研究结果表明，酰基溶胺及其衍生物在栽培和野生土豆的块茎外皮中广泛存在，其种类和浓度在不同物种和器官中表现出差异。例如，在S. tuberosum的块茎外皮中，C10:1-溶胺（编号10a）是最主要的化合物，而在S. pinnatisectum中，C10:1-溶胺（编号10a）和C10:2-溶胺（编号12a和12b）的含量较高。这些发现不仅丰富了我们对酰基溶胺在植物中的分布的认识，还为研究其在植物抗性中的作用提供了新的线索。

此外，研究还揭示了不同类型的酰基溶胺在碎片化过程中的行为差异。例如，羟基肉桂酰基溶胺（如C10:1-溶胺-N-氧化物）在碎片化过程中形成了丰富的酰基离子及其相关碎片，这使得它们的结构特征能够被进一步解析。而对于某些N-去甲基化衍生物，如C10:1-去甲基溶胺，其碎片离子光谱则表现出与普通酰基溶胺不同的特征，这可能与其结构的变化有关。

最后，本文的方法和数据为未来研究酰基溶胺及其衍生物在茄科植物中的分布、结构多样性以及生物活性提供了重要的资源。通过非靶向筛查和碎片化分析，研究人员不仅能够识别新的化合物，还能够深入理解它们的化学行为和可能的生物学功能。这些发现有助于推动植物化学和天然产物研究的发展，同时也为开发新的生物活性化合物提供了理论基础和实验支持。