新型双向启动子单载体系统高效生产抗狂犬病毒双特异性抗体及其中和活性研究

为解决狂犬病毒中和抗体开发中载体设计复杂、表达效率低的问题，研究人员开发了peaSKYA单载体系统，采用双向CMV启动子同步表达重链和轻链。该系统使双特异性抗体产量提高2倍，候选分子HHDVD在假病毒中和试验（PBNA）和快速荧光聚焦抑制试验（RFFIT）中分别表现出2193.19 IU/mg和1679.52 IU/mg的高中和活性，为狂犬病暴露后预防（PEP）提供了新型高效生物制剂。

　　

狂犬病是由嗜神经性狂犬病毒（RABV）引起的致命性人畜共患病，发病后死亡率近乎100%。尽管通过暴露后预防（PEP）联合疫苗接种和狂犬病免疫球蛋白（RIG）可有效预防，但当前使用的RIG产品仍存在诸多局限：人源RIG（HRIG）供应有限、成本高昂，而马源RIG（ERIG）则伴随血清病等安全风险。世界卫生组织（WHO）因此推荐将中和抗体（nAbs）作为RIG的替代方向，并强调需使用两种非重叠表位的单克隆抗体（mAbs）组合疗法以降低病毒逃逸风险。然而，双特异性抗体（bsAbs）虽能同时靶向两个不同表位、提供更优越的保护潜力，但其发展受限于复杂低效的载体设计和表达系统。

在这一背景下，Zhang等人在《BMC Biotechnology》发表研究，开发了一种名为peaSKYA的新型单载体系统，用于高效生产抗狂犬病毒的双特异性中和抗体。该系统采用最小化的载体设计，整合了双向双CMV启动子，实现了重链（HC）与轻链（LC）在单一载体内的同步共表达，不仅显著提升了抗体产量，还确保了正确的折叠与组装。

为开展本研究，作者主要运用了以下关键技术方法：

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  使用分子克隆技术构建了peaSKY系列载体，并通过无缝克隆组装表达盒；
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  利用HEK293F细胞进行瞬时转染与抗体表达；
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  通过Protein G亲和色谱纯化抗体；
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  采用SDS-PAGE、ELISA结合竞争抑制实验验证抗体结构与结合特性；
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  通过假病毒中和试验（PBNA）和快速荧光聚焦抑制试验（RFFIT）评估抗体中和效价。

设计并验证peaSKY载体

研究人员首先设计了一个最小化的过表达载体peaSKY001，剔除冗余的f1 origin序列，使载体大小降至2.9 kb，有效提高了表达盒与载体骨架的比例。实验表明，该载体驱动EGFP表达的能力比常规pEGFP-N1高出2倍，且转染效率在悬浮和贴壁HEK293F细胞中均达到70%–80%。进一步地，作者开发出含t-PA信号肽的分泌型载体peaSKY003，并成功表达出人IgG1-Fc同二聚体，证实该系统支持抗体分子的正确组装与分泌。

PeaSKYA单载体系统提升重组抗体表达

为解决双载体共转染中轻重链表达不平衡的问题，研究团队进一步构建了peaSKYA-IgG单载体。该载体使用双向双CMV启动子分别调控轻链和重链的表达，且所有调控元件（包括信号肽与多聚腺苷酸尾巴）完全一致，从而实现了转录与翻译的平衡。该单载体系统的功能效率达到68.8%，较双载体共转染（平均52.1%）提高32.1%。ELISA分析显示，单载体表达的人源化抗体H35和H49信号显著更强，而双特异性抗体HHDVD和HGLS的产量也提高了约2倍。

工程化双特异性抗体的表达与功能验证

利用H35和H49两个人源化抗体，研究者构建了四种四价对称型双特异性抗体，包括IgG(L)-scFv（轻链C端融合scFv）和DVD-Ig（N端可变区插入）两种结构。竞争ELISA结果表明，DVD-Ig格式的抗体（尤其是HHDVD）在结合活性和表位特异性方面表现更优，其结构稳定性高于scFv型抗体。所有抗体在HEK293F细胞中通过peaSKYA单载体成功表达，产量介于18.3–183.3 mg/L。SDS-PAGE在还原和非还原条件下均证实抗体分子量符合预期，且形成了完整的抗体结构。

HHDVD的结合亲和力与中和活性

间接ELISA测定显示，双特异性抗体HHDVD的结合活性（EC₅₀=2.5 ng/ml）优于亲本抗体，其中外域表位H49的亲和力（EC₅₀=3.9 ng/ml）高于内域表位H35（EC₅₀=21.4 ng/ml），符合DVD-Ig分子的一般特性。在中和能力方面，HHDVD在PBNA中效价达到2193.20±187.38 IU/mg，在RFFIT中为1679.52±58.01 IU/mg，分别比亲本抗体H49高出92%和46%，凸显了四价双特异性结构在中和病毒方面的显著优势。

该研究开发的peaSKYA单载体系统显著提高了双特异性抗体的生产效率与质量，为狂犬病及其他病毒性疾病的抗体疗法提供了一套可转移、高效且灵活的研发平台。双特异性抗体HHDVD展现出的优异中和活性，使其成为符合WHO标准的潜在PEP生物制剂，有望解决当前RIG产品面临的供应与安全难题。此外，该载体设计策略普遍适用于其他工程抗体的开发，具有广泛的生物医药应用前景。